4-（苯乙烯基）苯酚的合成及抗腫瘤活性研究*

王 璇，姜曉曄，黎七雄

（武漢城市學院 醫學部，湖北 武漢 430083）

二苯乙烯類天然產物廣泛的存在于自然界中，具有抗菌[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]、抗血小板凝聚[4]、抗衰老[5]、保護肝細胞[6]等多種生物活性，而近年來其展現出的抗腫瘤活性尤其引人關注[7-9]。在二苯乙烯類化合物中，白藜蘆醇是一個經典的代表藥物[10]，其在抗腫瘤方面被喻為是繼紫杉醇后又一新的綠色抗癌藥。然而，白藜蘆醇在體內存在抗腫瘤效能低、選擇性差、生物利用率低等缺點，使其臨床應用受到了嚴格的限制。因此，開發出新型的、高效的白藜蘆醇衍生物，已成為二苯乙烯類抗腫瘤藥物研發的一個熱點領域。目前，已有眾多的白藜蘆醇衍生物被報道[11-13]，其中部分衍生物的抗腫瘤活性甚至強于白藜蘆醇。例如，在2013 年杜成[14]等合成的白藜蘆醇衍生物抗HeLa 細胞增殖效果明顯的強于白藜蘆醇。

在本研究中，我們以（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯為原料，經過Wittig-Homor 反應以及BBr3脫甲基得到了一個白藜蘆醇4-（苯乙烯基）苯酚（4），產物結構經過1H NMR 確證。同時考察了影響反應的因素，并優化了反應條件。隨后，通過CCK-8 試劑盒評價了4-（苯乙烯基）苯酚對乳腺癌MCF-7、前列腺癌PC-3、宮頸癌HeLa 以及肝癌HepG2 細胞的抗腫瘤活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AV400 型核磁共振波譜儀（CDCl3為溶劑，TMS為內標，德國Bruker 公司）；OSB-2100 型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；DZF-1 型真空干燥箱（上海市百典儀器廠）；DLSB-10/20 型低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工有限公司）；MS-H-ProA磁力攪拌器（大龍興創實驗儀器（北京）股份公司）；ELx800 型酶標儀（美國博騰儀器有限公司）。

（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯、4-甲氧基苯甲醛三溴化硼、N,N-二甲基甲酰胺，均為分析純，購自百靈威科技有限公司；200～300 目柱層析硅膠，購自青島海洋化工廠；其他試劑均為市售分析純。

1.2 實驗方法

（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）與4-甲氧基苯甲醛（2）發生Wittig-Homor 反應得到4-甲氧基二苯乙烯（3），（3）經BBr3脫甲基得到目標化合物4-（苯乙烯基）苯酚（4）。合成路線見圖1。

圖1 4-（苯基乙烯基）苯酚（1）的合成路線Fig.1 Synthetic route of 4-styrylphenol（4）

1.2.1 4-甲氧基二苯乙烯（3）的合成 將原料（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）（45.6g，199.7mmol）溶解到200mL DMF 中，將反應液冷卻到0℃，加入甲醇鈉（5.0g，998.5mmol），保持低溫攪拌10min，再加入4-甲氧基苯甲醛（32.6g，239.6mmol），溶液變成紅色，保持室溫反應12h。將反應液傾入2L 的冰水中，析出黃色固體，過濾，濾餅真空干燥后用無水乙醇進行重結晶得到白色固體4-甲氧基二苯乙烯（3）（38.4g，91.5%）。產物結構經1H NMR 確證。1H NMR（400MHz, CDCl3）δ 7.46～7.57（m, 4H）,7.40（t, J=7.2Hz,2H）,7.30～7.35（m，1H），7.14（d，J=16.4Hz，1H），7.12（d，J=16.0Hz，1H）,6.91（d，J=8.0Hz，2H），3.89（s，3H）。

1.2.2 4-（苯乙烯基）苯酚（4）的合成 無水無氧并在Ar 保護下，將4-甲氧基二苯乙烯（3）（18.4g，87.5mmol）溶解到200mL 二氯甲烷中，將反應液冷卻至-20℃，滴加BBr3（65.7g，262.5mmol），-20℃繼續反應12h。在反應液中滴加2mL 的甲醇淬滅反應，再將反應液傾入2L 的冰水中，析出白色固體，過濾，濾餅真空干燥后用無水乙醇進行重結晶得到黃色固體4-（苯乙烯基）苯酚（4）（38.4g，86.9%）。產物結構經1H NMR 確證。1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ 8.58（s，1H），7.55（d，J=7.6Hz，2H），7.45（d，J=8.8Hz，2H）,7.36（t，J=7.6Hz，2H），7.23（d，J=7.6Hz，1H），7.19（d，J=16.8Hz，1H），7.07（d，J=16.4Hz，1H），6.86 （d，J=8.8Hz, 2H）。

1.3 抗腫瘤活性

取對數期的MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 細胞消化后鋪至96 孔板中，用培養基調整每孔的細胞濃度為（8～10）×103個。在37℃5% CO2中培養箱中孵育12h，棄去培養液，加入不同濃度（0, 100, 50,25, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05μM）的4-（苯乙烯基）苯酚（4），繼續孵育72h 后棄去培養液，每孔加入20μL CCK-8 溶液和180μL 的培養基，繼續孵育4h，在酶標儀上使用470nm 波長讀取每孔的吸光度（OD）值，計算出測試4-（苯乙烯基）苯酚的IC50值。

2 結果與討論

2.1 結構表征

通過1H NMR 對目標化合物4-（苯基乙烯基）苯酚（1）進行了結構表征，見圖2。

圖2 4-（苯基乙烯基）苯酚（4）的氫譜Fig.2 1H NMR of 4-styrylphenol（4）

由圖2 可見，化合物4-（苯基乙烯基）苯酚（4）具有一個-OH，其質子信號出現在低場，8.58×10-6處有一個單峰，并對應1 個H，這就是化合物1 中羥基的質子信號，表明通過BBr3已將4-甲氧基二苯乙烯（3）的甲基順利脫去，得到了目標羥基化合物1；此外，化學位移在7.19×10-6和7.07×10-6處有兩組雙峰并各對應1 個H，且其耦合常數均大于16Hz，這是4-（苯基乙烯基）苯酚中乙烯基的2 個質子信號；同時化學位移在7.55×10-6、7.45×10-6、7.36×10-6、7.23×10-6、7.07×10-6和6.86×10-6附近總共出現9 個質子信號，這正是4-（苯基乙烯基）苯酚中兩個苯環上9個H 的信號。

2.2 溶劑類型對化合物（3）收率的影響

在第一步Wittig-Homor 反應中，反應溶劑類型可能會影響收率。按照1.2.1 的操作方法，取（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）（1.5g，6.6mmol）溶解到10mL不同溶劑中，再按照n（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯∶n甲醇鈉=1∶5，加入甲醇鈉（1.8g，33.0mmol）以及4-甲氧基苯甲醛（1.1g，7.9mmol）等反應條件不變情況下，考察溶劑對化合物（3）收率的影響。結果見表1。

表1 溶劑類型對化合物（3）收率的影響Tab.1 Effect of solvent type on the yield of compound（3）

由表1 可見，使用甲醇和乙醇做溶劑時，收率較低，這可能是由于這兩種溶劑屬于質子性溶劑，影響Wittig-Homor 反應的進行，造成化合物（3）收率低。四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和18-冠-6-醚屬于非質子性溶劑，其在反應中不會游離出質子，性質較穩定，因此，采用這3 種溶劑獲得了高收率的化合物（3）。在這3 種非質子性溶劑中又以N，N-二甲基甲酰胺做溶劑獲得了最高收率，而N，N-二甲基甲酰胺又易溶于水，可以通過多次水洗將其除去，所以確定此反應中溶劑選用N，N-二甲基甲酰胺最佳。

2.3 堿的類型對化合物（3）收率的影響

在第一步Wittig-Homor 反應中，堿的類型對化合物（3）收率有重要的影響。按照1.2.1 的操作方法，取（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）（1.5g，6.6mmol）溶解到10mL DMF 中，加入5 個單量不同的堿以及4-甲氧基苯甲醛（1.1g，7.9mmol）等反應條件不變情況下，考察堿的類型對化合物（3）收率的影響。結果見表2。

表2 堿類型對化合物（3）收率的影響Tab.2 Effect of base type on the yield of compound（3）

由表2 可見，當甲醇鈉作為堿時化合物（3）的收率最高。甲醇鈉屬于強堿，這表明，強堿可能有利于此反應。的確，當使用另外一種強堿叔丁醇鉀時化合物（3）也有高的產率，但隨著堿性的降低產率也隨之降低，當采用中性的KCl 做催化劑時沒有產生化合物（3）。因此，確定此反應中選用甲醇鈉最佳。

2.4 物料比對化合物（3）收率的影響

在堿類型篩選實驗中，確定了甲醇鈉為最佳。接著探討了n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇鈉的物料比對反應的影響。按1.2.1 操作方法，取（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）（1.5g，6.6mmol）溶解到10mL DMF 中，加入不同當量的甲醇鈉以及4-甲氧基苯甲醛（1.1g，7.9mmol）等反應條件不變下，考察n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇鈉對化合物（3）收率的影響。結果見表3。

表3 物料比對化合物（3）收率的影響Tab.3 Effect of mole ratio on the yield of compound（3）

由表3 可見，n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇鈉=1∶5 時，化合物（3）的收率最高；當甲醇鈉的當量小于5 時，由于反應不充分造成化合物（3）的產率低；而當甲醇鈉的當量大于5 時，化合物（3）的產率也有所降低，這可能是由于過量的甲醇鈉引發了副反應造成的，同時考慮到節約試劑成本問題，因此，確定此反應n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇鈉=1∶5 為最佳投料比。

2.5 反應溫度與時間對化合物（3）收率的影響

反應溫度與時間對化合物（3）的產率也有一定的影響。按照1.2.1 的操作方法，取（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）（1.5g，6.6mmol）溶解到10mL DMF 中，n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇鈉=1∶5 以及4-甲氧基苯甲醛（1.1g，7.9mmol）等反應條件不變情況下，考察反應溫度與時間對化合物（3）收率的影響。結果見表4。

表4 反應溫度與時間對化合物（3）收率的影響Tab.4 Effect of reaction temperature and time on the yield of compound 3

由表4 可見，室溫反應12h 時化合物（3）的收率最高；當反應時間縮短為8h，化合物（3）的收率明顯降低，這可能是由于反應時間短，反應還未完全；當反應時間延長為24h 時，收率也沒有顯著地提高；此外，將反應溫度由室溫降為0℃，此時化合物（3）的收率降低；而當反應溫度升高為60℃時，化合物（3）的收率較室溫反應也有所降低，這可能是由于隨著溫度的升高副反應也增加所致。因此，確定此反應為室溫反應12h 為最佳。

2.6 脫甲基試劑種類對目標化合物（4）收率的影響

在第二步脫甲基化反應中，脫甲基試劑種類對目標化合物（4）的收率也重要的影響。按照1.2.2 的操作方法，取4-甲氧基二苯乙烯（3）（1.3g，6.2mmol）采用不同的脫甲基試劑和反應條件來考察其對化合物（4）收率的影響。結果見表5。

表5 脫甲基試劑種類對化合物（4）收率的影響Tab.5 Effect of demethylating reagent on the yield of compound（4）

由表5 可見，采用以二氯甲烷作為溶劑、BBr3作為脫甲基試劑，在-20℃下反應脫甲基效果最佳，化合物（4）的產率達到了86.9%，而采用HBr、乙醇鈉和AlCl3為脫甲基試劑得到的產率不足30%；盡管采用Al 和I2作為脫甲基試劑能夠使得化合物（4）的產率達到84.1%，但考慮到I2是一種有毒物質，容易對身體造成損傷，所以在此反應中BBr3為最佳脫甲基試劑。

2.7 BBr3 的用量對目標化合物（4）收率的影響

在第二步脫甲基化反應中，確定了BBr3為最佳脫甲基試劑，n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3的物料比可能對化合物（4）也有一定的影響。按照1.2.2 的操作方法，取4-甲氧基二苯乙烯（3）（1.3g，6.2mmol）溶解到15mL二氯甲烷中，-20℃下加入不同當量的BBr3來考察n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3對化合物（4）收率的影響。結果見表6。

表6 物料比對化合物（4）收率的影響Tab.6 Effect of mole ratio on the yield of compound（4）

由表6 可見，n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3=1∶3 時，化合物（4）的收率最高；當BBr3的當量小于3 時，由于脫甲基化試劑不夠造成化合物（4）的產率低；而BBr3的當量大于3 時，BBr3用于脫甲基量過剩，而BBr3活性高易發生副反應造成產率降低，因此，確定此反應的n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3=1∶3 為最佳投料比。

2.8 抗腫瘤活性

為了評價4-（苯乙烯基）苯酚4 的抗腫瘤效果，采用了CCK-8 試劑盒測試了其對MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 這4 種腫瘤細胞的抑制活性。結果見表7。

表7 4-（苯乙烯基）苯酚4 的體外抗腫瘤活性（n=3）Tab.7 Anti-proliferative activity of 4-styrylphenol 4（n=3）

由表7 可見，4-（苯乙烯基）苯酚4 對MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 腫瘤細胞均展現出了抑制活性，并對MCF-7 有更強的抑制活性，其IC50=（19.9±2.5）μmol·L-1。

3 結論

以（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）為原料，在甲醇鈉催化下，與4-甲氧基苯甲醛（2）反應制得4-甲氧基二苯乙烯（3），（3）再經經BBr3脫甲基得到了4-（苯乙烯基）苯酚（4）。產物結構通過核磁共振氫譜表征。

優化了反應條件：在Wittig-Homor 反應中，N，N-二甲基甲酰胺（DMF）為溶劑；甲醇鈉為催化劑；n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇鈉=1∶5；室溫反應時間12h；在脫甲基化反應中：BBr3為催化劑；n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3=1∶3；反應溫度為-20℃。優化條件下產物總收率為79.5%。通過生物活性測試表明，4-（苯乙烯基）苯酚對MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 均展現出了明顯的抑制活性。這些結果表明，4-（苯乙烯基）苯酚可作為抗腫瘤先導化合物進行更深入的研究。