華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的克隆及表達(dá)*

康曉彤 陳 輝

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院 廣州 510642)

華山松(Pinusarmandi)是中國(guó)特有的針葉樹(shù)種，在秦巴林區(qū)的森林生態(tài)系統(tǒng)中起著十分重要的作用，但秦巴林區(qū)的華山松長(zhǎng)期遭受華山松大小蠹(Dendroctonusarmandi)的危害，導(dǎo)致大量華山松死亡(Chenetal.,2006)。華山松大小蠹主要危害30年以上的華山松，造成寄主樹(shù)木迅速衰弱，后期引發(fā)多種次期性小蠹聯(lián)合入侵(Chenetal.,2007;2010)。華山松大小蠹所攜帶的藍(lán)變真菌秦嶺細(xì)粘束孢(Leptographiumqinlingensis)在華山松大小蠹入侵之時(shí)就開(kāi)始破壞華山松樹(shù)脂分泌系統(tǒng)，分解寄主樹(shù)木木質(zhì)部樹(shù)脂道泌脂細(xì)胞，隨著菌絲在寄主樹(shù)木樹(shù)脂道內(nèi)大量繁殖，樹(shù)木的薄壁細(xì)胞被分解，在華山松大小蠹的協(xié)同作用下，導(dǎo)致寄主樹(shù)木的迅速死亡(唐明等，1999)。

萜類(lèi)化合物(Terpenoids)是針葉樹(shù)樹(shù)脂的主要成分，由單萜類(lèi)(C10)、倍半萜類(lèi)(C15)和二萜類(lèi)(C20)化合物組成，寄主植物分泌的萜類(lèi)化合物不僅可以作為趨避劑或毒素對(duì)抗植食性昆蟲(chóng)和致病菌，還可以作為昆蟲(chóng)識(shí)別寄主植物的主要途徑或寄主植物的引誘劑(Bohlmannetal.,1999;Phillipsetal.,1999;Trappetal.,2001;Martinetal.,2002；2003)。針葉樹(shù)釋放的單萜類(lèi)揮發(fā)物可作為小蠹蟲(chóng)的寄主識(shí)別信號(hào)，小蠹蟲(chóng)入侵寄主樹(shù)木可誘導(dǎo)寄主揮發(fā)性物質(zhì)變化，進(jìn)而吸引天敵(Hilkeretal.,2002;Mummetal.,2003)。霍燕等(2010)研究發(fā)現(xiàn)不同被害階段華山松韌皮部釋放的單萜類(lèi)揮發(fā)物中α-蒎烯相對(duì)含量最高，檸檬烯含量則呈增加趨勢(shì)。北美云杉(Piceasitchensis)在受到象甲危害后，alpha-pinene synthase基因開(kāi)始上調(diào)，木質(zhì)部樹(shù)脂道α-蒎烯含量也隨之升高；用鉆孔的方式模擬象甲取食，發(fā)現(xiàn)(-)-limonene synthase基因轉(zhuǎn)錄水平升高，檸檬烯含量也相應(yīng)增加(Byun-McKayetal.,2003,2006)。大量研究表明alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因是松科植物與防御相關(guān)重要的單萜合酶基因，且萜類(lèi)化合物合成與代謝受萜類(lèi)合酶(terpene synthases，TPS)基因調(diào)控(Byun-McKayetal.,2003；2006;Keelingetal.,2011;Chenetal.,2019)。目前松科(Pinaceae)植物關(guān)于TPS的研究主要集中于大冷杉(Abiesgrandis)、挪威云杉(Piceaabies)和北美云杉，火炬松(Pinustaeda)、海岸松(Pinuspinaster)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、馬尾松(Pinusmassoniana)也有部分研究報(bào)道。

在針葉樹(shù)木萜類(lèi)化合物生化和分子防御研究中通常采用機(jī)械性創(chuàng)傷(Gijzenetal.,1992;Bohlmannetal.,1997;Steeleetal.,1998)或茉莉酸甲酯(MeJA)處理模擬昆蟲(chóng)的入侵危害(Richardetal.,2000;Martinetal.,2002；2003;F?ldtetal.,2003)。大量研究表明MeJA引起的創(chuàng)傷性樹(shù)脂與針葉樹(shù)木受到昆蟲(chóng)和病原體入侵的反應(yīng)非常相似(Croiséetal.,1993;Franceschietal.,2002;Martinetal.,2002)。

華山松大小蠹主要危害30年以上健康華山松(李臻等，2009)，華山松大小蠹成蟲(chóng)入侵寄主華山松后，在藍(lán)變真菌的協(xié)調(diào)作用下，產(chǎn)生抵御寄主華山松萜烯類(lèi)化合物等生理生化抗性(唐明等，1999;Daietal.,2019；2020)，但由于華山松大小蠹和藍(lán)變真菌誘導(dǎo)寄主華山松萜類(lèi)合酶相關(guān)基因研究的滯后，成為制約揭示華山松大小蠹發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵因素之一。本研究針對(duì)華山松大小蠹入侵危害的特異性，以2年生華山松幼苗為試驗(yàn)材料，利用MeJA處理和接種秦嶺細(xì)粘束孢模擬華山松大小蠹和藍(lán)變真菌的入侵危害，克隆受華山松大小蠹和藍(lán)變真菌危害后寄主華山松萜類(lèi)合酶中alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因cDNA的全長(zhǎng)，分析alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表達(dá)特性，為深入了解華山松大小蠹和藍(lán)變真菌抵御華山松抗性的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑 試驗(yàn)材料為2年華山松幼苗；Plant RNA Kit植物總RNA提取試劑盒購(gòu)于Omega Bio-Tek公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing RT Kit(With gDNase)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于天根生物有限公司；EasyPure?Quick Gel Extraction Kit購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD?18-T載體購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；Trans5α Chemically Competent Cell購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×EasyTaq?PCR SuperMix購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；Trans2K?Plus DNA Marker購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；RACE試劑盒SMARTer RACE cDNA Amplification Kit購(gòu)于TaKaRa公司；茉莉酸甲酯(純度≥95%)購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；秦嶺細(xì)粘束孢分離自秦嶺火地塘林區(qū)被害華山松藍(lán)變韌皮部和木質(zhì)部組織。

1.2 華山松韌皮部總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成 切取健康的華山松韌皮部組織，放入液氮中充分研磨，使用Plant RNA Kit植物總RNA提取試劑盒提取華山松韌皮部總RNA。提取的總RNA使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量，NanoDrop超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和OD值。cDNA第一鏈合成利用FastKing RT Kit(With gDNase)反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成。

1.3 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因保守區(qū)cDNA片段的擴(kuò)增 根據(jù)NCBI已報(bào)道其他松科植物alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的序列(Trindadeetal.,2016;Halletal.,2013;Byun-McKayetal.,2006;Martinetal.,2004)，使用DNAMAN進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)，擴(kuò)增alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因片段。引物由上海生物工程有限公司合成，產(chǎn)物的反應(yīng)體系為20 μL，包括1 μL cDNA模板，上下游引物各0.5 μL，10 μL 2×EasyTaq?PCR SuperMix和8 μL RNase-free H2O。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠回收目的條帶，將目的條帶連接到pMD?18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆子送往生工生物工程(上海)公司測(cè)序。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.4 alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的3′RACE擴(kuò)增 根據(jù)保守片段的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)基因特異性上游引物(表1)，并分別與3′RACE試劑盒中對(duì)應(yīng)引物3′RACE Outer Primer和3′RACE Inner Primer組合，進(jìn)行巢式PCR，以獲得alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的3′非翻譯區(qū)。第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與程序同上，以第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠回收目的條帶，將目的條帶連接到pMD?18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子送往生工生物工程(上海)公司測(cè)序。將測(cè)序所得的片段用DNAMAN進(jìn)行拼接，獲得含有3′末端的alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的部分序列。

1.5 alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的5′RACE擴(kuò)增 根據(jù)DNAMAN的拼接結(jié)果，設(shè)計(jì)基因特異性下游引物(表1)，并分別與5′RACE試劑盒中的對(duì)應(yīng)引物5′RACE Outer Primer和5′RACE Inner Primer組合進(jìn)行巢式PCR，以獲得alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的5′非翻譯區(qū)。第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與程序同上，以第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠回收目的條帶，將目的條帶連接到pMD?18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子送往生工生物工程(上海)公司測(cè)序。將測(cè)序所得的片段與3′RACE的拼接序列用DNAMAN進(jìn)行拼接，獲得華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的cDNA序列。

1.6 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因基因序列分析 對(duì)克隆獲得的基因進(jìn)行序列分析，在NCBI上對(duì)華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因序列同源性比對(duì)，使用在線工具ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)推導(dǎo)基因編碼蛋白質(zhì)的分子量及理論等電點(diǎn)，通過(guò)SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。選取蛋白同源性較高的植物的蛋白序列，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.7 MeJA處理 將MeJA溶于0.1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫20(Tween 20)溶液中，配置成體積分?jǐn)?shù)有0.01%的MeJA溶液，取100 mL溶液，在20 min內(nèi)均勻噴灑于華山松幼苗上，以0.1%(體積分?jǐn)?shù))的Tween 20溶液為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)15株，共處理30株。在處理的0 (未處理)、2、4、8和16 天取樣，于-80 ℃保存。

1.8 秦嶺細(xì)粘束孢處理 在華山松幼苗距地面15 cm處用直徑5 mm打孔器鉆孔，將秦嶺細(xì)粘束孢接種于各孔中，用保鮮膜包裹，對(duì)照組幼苗只打孔，不接種真菌，每個(gè)處理重復(fù)15株，共處理30株。在處理的0(未處理)、2、4、8和16天取樣，于-80 ℃保存。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因，選用18S RNA為內(nèi)參基因(Phametal.,2016)，用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物(表1)。分別提取MeJA和秦嶺細(xì)粘束孢處理后0、2、4、8、16天的華山松韌皮部和對(duì)照組總RNA?？俁NA提取和第一鏈cDNA合成方法同上。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。生物學(xué)重復(fù)為3次，技術(shù)性重復(fù)為2次。采用log22-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性分析，GraphPad 8.0.2作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因全長(zhǎng) 利用PCR與RACE技術(shù)從華山松中克隆出alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因全長(zhǎng)cDNA。華山松alpha-pinene synthase基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1887 bp，共編碼628個(gè)氨基酸，其編碼蛋白的分子量為71.59 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為5.86，該基因序列已提交至GenBank，登錄號(hào)為MW234460。Expasy Protscale對(duì)alpha-pinene synthase基因蛋白的親水性分析，表明該蛋白是親水性蛋白。華山松(-)-limonene synthase基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 905 bp，共編碼634個(gè)氨基酸，其編碼蛋白的分子量為73.01 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為5.97，該基因序列已提交至GenBank，登錄號(hào)為MW234461。在線軟件Expasy Protscale對(duì)(-)-limonene synthase基因蛋白的親水性進(jìn)行分析，表明該蛋白是親水性蛋白。通過(guò)SWISS-MODEL的Automated Mode華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因進(jìn)行同源建模，構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖1)。

圖1 華山松TPS基因三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Tertiary structure analysis of TPS gene in P. armandi

2.2 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因編碼氨基酸序列分析 利用NCBI中的Blastx比對(duì)alpha-pinene synthase基因編碼的氨基酸序列，結(jié)果顯示華山松alpha-pinene synthase基因與馬尾松的相似度分別為84.90%，與海岸松的相似度分別為84.10%，與北美云杉的相似度為82.96%；華山松(-)-limonene synthase基因與挪威云杉的相似度為82.39%，與北美云杉的相似度為82.39%。

TPS根據(jù)其蛋白序列的相關(guān)性分為6類(lèi)，即Tpsa、Tpsb、Tpsc、Tpsd、Tpse和Tpdf(Bohlmannetal.,1998;Keelingetal.,2006;Trappetal.,2001)，其中裸子植物的TPS基因與被子植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，形成了相對(duì)獨(dú)立的家族(Bohlmannetal.,1998)，即Tpsd，該基因家族又被分為單萜合成酶(Tps-d1)、倍半萜合成酶(Tps-d2)和二萜合成酶(Tps-d3)3類(lèi)(Keelingetal.,2006;Byun-McKayetal.,2006)。根據(jù)alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因編碼氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果，選取裸子植物其他物種的TPS基因編碼的氨基酸序列，通過(guò)MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖2)，結(jié)果表明華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因均屬于Tpsd-1家族，并且華山松alpha-pinene synthase基因與松屬的alpha-pinene synthase基因在同一分支上，華山松(-)-limonene synthase基因與云杉屬的(-)-limonene synthase基因在同一分支上。

圖2 華山松TPS與其他裸子植物TPS基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree based on amino acid sequences of TPS gene from P. armandi and other gymnosperm

2.3 MeJA處理下華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表達(dá)特性 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因均受MeJA誘導(dǎo)表達(dá)(圖3)，MeJA處理后alpha-pinene synthase基因表達(dá)量在第2、4 天顯著增加，分別是對(duì)照的4.51、2.83倍，第2 天達(dá)到極顯著水平。MeJA處理后(-)-limonene synthase基因表達(dá)量也呈上調(diào)趨勢(shì)，在第2、4天比對(duì)照分別增加2.1、2.35倍。說(shuō)明MeJA處理可以誘導(dǎo)華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表達(dá)。

圖3 MeJA處理下華山松TPS基因表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of TPS gene of P. armandi in MeJA treatedt檢驗(yàn)結(jié)果Student’s t-test：*，P<0.05；**，P<0.01.下同。The same below．

2.4 接種秦嶺細(xì)粘束后華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表達(dá)特性 華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因均受秦嶺細(xì)粘束孢誘導(dǎo)表達(dá)，在處理后不同時(shí)間的表達(dá)量有不同程度的增加(圖4)，接種秦嶺細(xì)粘束孢后alpha-pinene synthase基因表達(dá)量在第4、8和16天達(dá)到顯著水平，分別提高1.87、3.98和10.30倍，其中第16 天達(dá)到極顯著水平。(-)-limonene synthase基因表達(dá)量在第4、16 天差異顯著，分別提高4.55、8.88倍，并且在第16 天基因表達(dá)量達(dá)到極顯著水平。說(shuō)明華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在接種秦嶺細(xì)粘束孢后均有不同程度的上調(diào)表達(dá)，但在接種后不同時(shí)間的表達(dá)強(qiáng)度存在差異。

圖4 接種秦嶺細(xì)粘束孢后華山松TPS基因表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of TPS gene of P. armandi in L. qinlingensis post inoculation

3 討論

針葉樹(shù)木抵御病蟲(chóng)害的防御體系包括原生性防御和誘導(dǎo)性防御(Tomlinetal.,1997;Huberetal.,2004)，在這2種防御中樹(shù)脂起著十分重要的作用(Phillipsetal.,1999;Trappetal.,2001;Huberetal.,2004;Martinetal.,2005)。針葉樹(shù)木樹(shù)脂是由單萜，倍半萜和二萜樹(shù)脂酸組成的混合物(Phillipsetal.,1999;Martinetal.,2002)，眾多研究表明樹(shù)脂是針葉樹(shù)木抵御小蠹蟲(chóng)和共生藍(lán)變真菌入侵危害重要抗性物質(zhì)，特別是以樹(shù)脂為主的揮發(fā)性萜類(lèi)物質(zhì)在抵御小蠹蟲(chóng)和藍(lán)變真菌入侵寄主樹(shù)木時(shí)發(fā)揮著更為重要的作用(Christiansenetal.,1987;Paineetal.,1997;Franceschietal.,2005)。華山松大小蠹是秦嶺健康華山松的優(yōu)勢(shì)先鋒害蟲(chóng)，攜帶的藍(lán)變真菌是華山松大小蠹成功入侵的必要條件，當(dāng)華山松遭受華山松大小蠹和藍(lán)變真菌的侵害時(shí)，其體內(nèi)的揮發(fā)性物質(zhì)在種類(lèi)和含量上發(fā)生改變，從而抵御華山松大小蠹和藍(lán)變真菌的進(jìn)一步傷害(Phametal.,2014)。

大量研究表明，通常用MeJA處理模擬昆蟲(chóng)或病原體的入侵危害，MeJA處理挪威云杉后能夠誘導(dǎo)復(fù)雜的外傷性樹(shù)脂反應(yīng)，包括木質(zhì)部中外傷性樹(shù)脂導(dǎo)管的分化，單萜和二萜的積累增加，以及誘導(dǎo)酶活性、單萜合酶和二萜合酶的基因表達(dá)(Franceschietal.,2002;Martinetal.,2002;F?ldtetal.,2003)。Milleretal(2005)研究發(fā)現(xiàn)，象甲和MeJA能在北美云杉中誘導(dǎo)出相似的萜類(lèi)防御反應(yīng)。本研究用MeJA模擬華山松大小蠹入侵，研究華山松大小蠹危害后華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的表達(dá)，結(jié)果表明華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在MeJA處理后韌皮部的表達(dá)量顯著增加，并且alpha-pinene synthase基因在2天時(shí)轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高峰，這與北美云杉MeJA處理后(-)-alpha-pinene synthase基因反應(yīng)基本一致(Milleretal.,2005)。(-)-limonene synthase基因在4天時(shí)轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高峰，與北美云杉(-)-limonene synthase基因在受傷后4～7天達(dá)到峰值的研究結(jié)果基本一致(Byun-McKayetal.,2006)，這進(jìn)一步說(shuō)明alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在針葉樹(shù)木抵御有害生物危害中發(fā)揮著非常重要的作用。

Pham等的(2014)研究表明，接種秦嶺細(xì)粘束孢可以誘導(dǎo)華山松幼苗韌皮部和木質(zhì)部中單萜和倍半萜含量的升高，隨藍(lán)變真菌的入侵誘導(dǎo)寄主華山松分泌更多的樹(shù)脂，以抵御菌絲生長(zhǎng)和蔓延，從而使韌皮部和木質(zhì)部萜類(lèi)物質(zhì)積累。Tholl(2006)研究表明針葉樹(shù)木產(chǎn)生的萜類(lèi)化合物受萜類(lèi)合酶基因調(diào)控，其中alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的調(diào)控作用最為顯著。本研究在秦嶺細(xì)粘束孢接種華山松后，華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在不同時(shí)間均有明顯的響應(yīng)，且在處理后不用時(shí)間變化存在顯著差異，這說(shuō)明華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的上調(diào)表達(dá)是秦嶺細(xì)粘束孢誘導(dǎo)的結(jié)果，華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因是抵御華山松大小蠹和藍(lán)變真菌入侵的主要因素之一。

4 結(jié)論

本研究克隆了華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因，alpha-pinene synthase基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 887 bp，編碼628個(gè)氨基酸，編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為71.59 kDa，理論等電點(diǎn)為5.86，屬于親水性蛋白；(-)-limonene synthase基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)為1905 bp，編碼634個(gè)氨基酸，編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為73.01 kDa，理論等電點(diǎn)為5.97，屬于親水性蛋白。華山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在MeJA處理和秦嶺細(xì)粘束孢接種后表達(dá)量上調(diào)，是寄主華山松響應(yīng)華山松大小蠹和藍(lán)變真菌入侵危害的關(guān)鍵基因，也在寄主華山松抵御華山松大小蠹和藍(lán)變真菌入侵危害中發(fā)揮著重要作用，這一研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步解析秦嶺巴山林區(qū)華山松大小蠹的發(fā)生機(jī)制具有重要的理論價(jià)值。