UPLC-MS/MS 法測定煙葉中呋蟲胺及其代謝物的殘留

楊志富，歐曉明，曾利紅，梁 驥，梁貴平，劉義珂

（湖南化工研究院有限公司，國家農(nóng)藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，農(nóng)用化學(xué)品湖南省重點實驗室，湖南加法檢測有限公司，湖南 長沙 410014）

呋蟲胺（dinotefuran），化學(xué)名稱為1-甲基-2-硝基-3-（四氫-3-呋喃甲基）胍，簡稱DNF，是日本三井化學(xué)株式會社開發(fā)的第三代煙堿類殺蟲劑，其殺蟲譜廣，內(nèi)吸、滲透作用卓越[1]，作用于乙酰膽堿受體，使昆蟲麻痹致死[2]。

呋蟲胺使用后，在動植物體內(nèi)可產(chǎn)生多個代謝產(chǎn)物。研究表明，呋蟲胺以莖葉噴霧和土壤表面施藥的方式使用后，在水稻植株、糙米、稻殼上的主要代謝物為1-甲基-3-[（3-四氫呋喃）甲基]脲（簡稱UF）和1-甲基-3-[（3-四氫呋喃）甲基]二氫胍鹽（簡稱DN），DNF、UF、DN 的分子結(jié)構(gòu)式見圖1。2012 年農(nóng)藥殘留聯(lián)席會議（JMPR）規(guī)定，呋蟲胺在植物體內(nèi)的殘留物監(jiān)測定義為呋蟲胺，膳食風(fēng)險評估定義為呋蟲胺與UF、DN 的總和[3]。

圖1 呋蟲胺及其代謝物DN、UF 分子結(jié)構(gòu)式

目前，檢測DNF、UF、DN 殘留的方法主要為液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，涉及到的樣品基質(zhì)為水稻[4-7]、蔬菜[8-11]、水果[12]、棉花[10]、茶葉[13]、蜂產(chǎn)品[14]等。相同農(nóng)藥在不同作物中檢測因內(nèi)含物不同對檢測方法的要求也不同，煙葉中含有較多色素、生物堿、類脂、多酚物質(zhì)等會干擾目標(biāo)物的檢測，目前尚未見煙葉中關(guān)于呋蟲胺檢測的相關(guān)報道。國際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTE）和中國煙草總公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YQ50—2014 煙葉農(nóng)藥最大殘留限量[15]）暫未制定煙草中呋蟲胺的最大殘留限量，呋蟲胺在我國也暫未在煙草上獲得登記。受農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)委托，筆者以15%呋蟲胺·聯(lián)苯菊酯可濕性粉劑在煙草上的殘留登記試驗項目為背景，建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定煙葉中DNF、UF、DN 殘留的分析檢測方法，以期為煙葉中呋蟲胺及其代謝物殘留量的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集湖南試驗點種植的中煙90 煙葉作為空白樣品，參考YC/T 42—1996 煙草基本烘烤技術(shù)規(guī)程[16]烘烤成干煙葉，烘烤后的干煙葉空白樣品粉碎后-18℃以下密封保存。

主要試劑有呋蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品[99.0%，國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（沈陽）]，呋蟲胺代謝物UF 標(biāo)準(zhǔn)品（93.2%，上海安譜試驗科技股份有限公司），呋蟲胺代謝物DN 標(biāo)準(zhǔn)品（98.8%，上海安譜試驗科技股份有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，安可化工有限公司），甲酸（色譜純，上海安譜實驗室有限公司），試驗用水為超純水。

主要儀器有Agilent 1290/G6470 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）、SPS 402F 型電子天平[0.01g，梅特勒·托利多（常州）測量技術(shù)有限公司]、AL204 型電子天平[0.000 1g，梅特勒·托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]、Hei-vap 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[海道爾夫儀器設(shè)備（上海）有限公司]。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 （1）單個標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取DNF、UF、DN 的標(biāo)準(zhǔn)品各 0.025 g（精確至0.000 1 g），以乙腈溶解并定容至50 mL，分別配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L 的單個標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20℃避光密封儲存?zhèn)溆谩＃?）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確量取一定體積的單個標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/L 的DNF、UF 和DN 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20℃保存?zhèn)溆谩６繙y定時，用乙腈和煙葉空白基質(zhì)提取液配制溶劑和基質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理 稱取煙葉2 g（精確至0.01 g）于50 mL 的離心管中，加入20 mL 提取液（丙酮、乙腈、甲醇、超純水和0.5%的甲酸溶液）超聲15 min 后渦旋2 min，5 000 r/min 離心3 min，過濾，重復(fù)提取1 次，合并上清液并取4 mL 轉(zhuǎn)入裝有不同量（60、80、100 mg）凈化材料[石墨化碳黑（GCB）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、C18 凈化劑]的5 mL 離心管中，渦旋2 min，5 000 r/min 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液并用甲醇-水（體積比1 ∶1）混合溶液定容至5 mL 容量瓶中，過0.22 μm 濾膜，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.3 儀器分析條件 （1）色譜條件：Agilent EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A（0.1%甲酸水溶液）；流動相B（0.1%甲酸甲醇溶液）；柱溫30℃；進樣體積5 μL；通過降低流速和調(diào)整流動相初始比例（原則是前處理后得到的待測樣品中各溶劑比例與流動相中各溶劑比例相適應(yīng)）等手段優(yōu)化色譜條件。（2）質(zhì)譜條件：配制0.1 mg/L 的DNF、DN、UF單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，全掃描確定母離子后，采用自動調(diào)諧對各目標(biāo)化合物進行質(zhì)譜條件優(yōu)化，從而得到最優(yōu)質(zhì)譜測定條件。

1.2.4 方法學(xué)驗證 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及基質(zhì)效應(yīng)：煙葉中含有大量的雜質(zhì)，雖經(jīng)過PSA 和C18 凈化，但殘存的雜質(zhì)仍可能對農(nóng)藥目標(biāo)物產(chǎn)生較強的基質(zhì)效應(yīng)，對檢測結(jié)果造成影響。為驗證基質(zhì)效應(yīng)，用乙腈和煙葉空白基質(zhì)提取液分別配制1、2、5、20、50、100 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，根據(jù)試驗確定的儀器分析條件平行測定3 次，以目標(biāo)物峰面積（y）對其質(zhì)量濃度（x，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算基質(zhì)標(biāo)液與溶劑標(biāo)液的斜率比，即基質(zhì)效應(yīng)（ME）。（2）定量限（LOQ）：經(jīng)空白煙葉加標(biāo)試驗，以10 倍信噪比時空白基質(zhì)加標(biāo)濃度確定方法的定量限。（3）回收率和精密度：在空白基質(zhì)中進行添加回收試驗，添加水平為0.05、1.0、10 mg/kg，每個添加水平重復(fù)5 次，考察該檢測方法的回收率和精密度。

1.2.5 樣品檢測 采用該研究建立的檢測方法對2019年采集自湖南永州、山東青島、貴州黔南州、云南曲靖、廣西桂林、遼寧遼陽、福建福安的煙葉樣品（依托于15%呋蟲胺·聯(lián)苯菊酯可濕性粉劑在煙草上的殘留登記試驗項目）進行檢測。15%呋蟲胺·聯(lián)苯菊酯可濕性粉劑以劑量56.25 g/hm2（有效成分，制劑375 g/hm2）在處理小區(qū)施藥1 次，于施藥后間隔14、21 d采集煙葉樣品進行檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取溶劑

呋蟲胺的極性、親水性較強，且在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。在空白煙葉中添加1.0 mg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果顯示，丙酮、甲醇作為提取液時，3 種目標(biāo)物的回收率均在60%以下；當(dāng)乙腈作為提取液時DN 的回收率為65%，DNF 的回收率為70%、UF 的回收率為72%；純水的提取效果較好，3 種目標(biāo)物的回收率均在73%～77%之間；當(dāng)采用0.5%甲酸溶液提取時，3 種目標(biāo)物的回收率上升到82%～88%之間，表明適當(dāng)酸性條件有助于目標(biāo)物的離子化，以便提高回收率。故試驗確定以0.5%甲酸溶液為最佳提取溶劑。

2.2 最適凈化材料

為保護儀器，降低提取液中雜質(zhì)引起的基質(zhì)效應(yīng)，研究對凈化材料及其用量進行了探索。GCB 對色素有很好的吸附效果，但可能會對與其平面結(jié)構(gòu)類似的某些農(nóng)藥有較強的吸附作用，從而影響檢測結(jié)果；因此，GCB 凈化時，3 種目標(biāo)物的回收率都很低，為30%～55%。PSA 可去除煙草中的極性色素、類脂等雜質(zhì)，且雜質(zhì)干擾較少，當(dāng)使用量在80 mg 時效果最佳，3 種目標(biāo)物的回收率在70%～110%之間。C18 對煙草中的非極性組分具有較強的吸附作用，且雜質(zhì)干擾也較少，當(dāng)使用量在80 mg 時效果最佳，3 種目標(biāo)物的回收率在70%～105%之間。鑒于此，該研究采用80 mg PSA+80 mg C18作為凈化材料，其除雜效果可疊加，雜質(zhì)干擾也最少，回收率在75%～98%之間。

煙葉樣品提取后，用甲醇-水（體積比1 ∶1）混合溶液定容至5 mL，使待測液與流動相初始比例相似，從而獲得較好的峰形，同時稀釋提取液也可降低基質(zhì)本底的干擾。

2.3 最佳檢測條件

優(yōu)化后的梯度洗脫程序見表1。優(yōu)化后的色譜條件如下：電噴霧離子源；正離子電離模式（ESI+）；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子噴霧電壓為3.5 kV；霧化器壓力為0.31 MPa；干燥氣溫度為300℃；干燥氣流速5 L/min；鞘氣流速11 L/min；電噴霧質(zhì)譜參數(shù)信息見表2。

表1 液相梯度洗脫程序

表2 電噴霧質(zhì)譜參數(shù)

以上述參數(shù)獲得的DN、UF、DNF 基質(zhì)標(biāo)MRM圖如圖2 所示，3 種目標(biāo)物的保留時間恰當(dāng)，獲得峰形較好。往流動相A（超純水）和流動相B（甲醇）中分別加入0.1%的甲酸可以提高3 種目標(biāo)物的離子化效率，進而增強響應(yīng)。

圖2 1 μg/L 的DN、UF、DNF 基質(zhì)標(biāo)MRM 圖

2.4 方法學(xué)驗證結(jié)果

2.4.1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng) 煙葉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中，3 種目標(biāo)物在1～100 μg/L 范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均≥0.994 8（表3）。當(dāng)ME ＞1.1 時，表示基質(zhì)增強效應(yīng)；ME ＜0.9 時，表示基質(zhì)效應(yīng)減弱；0.9 ＜ME ＜1.1 時，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。由表3 可知，3 種目標(biāo)物在煙葉基質(zhì)中存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，故該研究選擇通過基質(zhì)匹配外標(biāo)法進行定量。

表3 3 種目標(biāo)物的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 定量限（LOQ） 經(jīng)空白煙葉加標(biāo)試驗，以10倍信噪比時空白基質(zhì)加標(biāo)濃度確定方法的定量限，DNF、DN、UF 的定量限均為0.05 mg/kg。因樣品經(jīng)過前處理后將實際濃度稀釋了25 倍進樣檢測，相較于呋蟲胺在煙草上暫未制定最大殘留限量（MRL）值，0.05 mg/kg 的定量限可滿足檢測要求。

2.4.3 回收率和精密度 如表4 所示，DNF、UF、DN 在煙葉中的平均回收率為88%～92%、77%～92%、87%～92% ，RSD 為2%～11%、2%～8%、2%～3%。以上結(jié)果均滿足NY/T 788—2018 農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則的要求[17]。

表4 DNF、UF 和DN 在煙葉中的添加回收率（n=5）

2.5 樣品檢測

根據(jù)JMPR2012 年的評估報告，按殘留物監(jiān)測定義計算，各樣品煙葉中呋蟲胺的殘留量最大值為2.45 mg/kg；按殘留物膳食攝入風(fēng)險評估定義（以呋蟲胺表示的殘留量=呋蟲胺殘留量+UF 殘留量×1.3+DN殘留量×1.3）計算，各樣品煙葉中以呋蟲胺表示的殘留量最大值為5.75 mg/kg。

3 結(jié) 論

為準(zhǔn)確測定煙草樣品中呋蟲胺（DNF）及其代謝物（DN、UF）的殘留量，建立了煙草樣品中DNF、DN、UF 的提取及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測的方法。樣品經(jīng)0.5%甲酸水溶液超聲提取，80 mg PSA+80 mg C18混合凈化劑凈化，用Agilent EC-C18色譜柱分離，再采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜測定。結(jié)果表明：DNF、DN、UF 在1～100 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.994 8；DNF、DN、UF 在煙葉中的最低檢測濃度均為0.05 mg/kg；不同加標(biāo)水平的試驗中DNF、DN、UF 的平均回收率分別為88%～92%、77%～92%和87%～92%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2%～11%、2%～8%、2%～3%。該方法操作簡單、快速，正確度和精密度均較高，可同時檢測煙葉中DNF、DN、UF 的殘留量，能滿足煙草中呋蟲胺的監(jiān)測及該藥的登記試驗需求。