鯽魚與草魚的腸道微生物區(qū)系及主要消化酶活性研究

譚 愷，徐 燦

（上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

鯽魚（Carassius auratus）在我國擁有悠久的養(yǎng)殖歷史，是我國最常見的雜食性淡水魚類之一，同時也是優(yōu)質(zhì)的養(yǎng)殖魚類和經(jīng)濟魚類，具有適應力強、繁殖能力高、抗病害能力好、生長快等特點[1]。草魚（Ctenopharyngodon idella）作為“四大家魚”之中草食性魚類的典型代表，是全球淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的一個品種，在全國范圍內(nèi)分布廣泛，具有飼養(yǎng)簡單、生長周期短、產(chǎn)量高等顯著特點，但抗病害能力相對較差[2]。

胃腸道作為整個機體同外界最廣泛接觸的器官之一。它不僅承擔著消化吸收機體攝入的營養(yǎng)物質(zhì)的功能，同時也是機體為了阻止腸道細菌移位而設立的一道重要防線。同大多數(shù)生物一樣，魚類的腸道內(nèi)也棲居著大量的微生物。在漫長的進化過程中，這些微生物與宿主之間建立起了長期且穩(wěn)定的共生關系，進而直接影響著宿主的飲食習慣、身體機能等。除此之外，腸道內(nèi)的酶活性也在很大程度上影響著魚的各項生理功能，其活性更是直接決定了機體對于營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收程度[3]。草魚和鯽魚是市面上兩種主要的魚類，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要的經(jīng)濟地位。研究魚腸道中微生物及酶活，能夠在養(yǎng)殖過程中為魚類健康狀況提供具體評價指標，同時對魚病的防治及飼料的開發(fā)提供重要的指導意義。

筆者選取同一人工養(yǎng)殖水域，生活環(huán)境完全一致的草魚和鯽魚進行試驗，探究鯽魚與草魚在腸道微生物區(qū)系和腸道主要消化酶活性的差異，進一步分析其對于魚類本身的飲食習慣和健康狀況的影響，以期為鯽魚和草魚的養(yǎng)殖與生活習性機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集于2019 年7 月21 日，在湖南省漣源市橋頭河鎮(zhèn)某村，選取無生活污水污染、未投放人工飼料，且多種魚類混養(yǎng)的池塘。采集喂養(yǎng)時間和生活環(huán)境一致的草魚和鯽魚各5 尾，將活魚帶回湖南省長沙市湖南中醫(yī)藥大學微生物學實驗室進行處理。草魚重（1 450±10）g/尾，鯽魚重（440±10）g/尾。

1.1.2 培養(yǎng)基腸道細菌總數(shù)的測定使用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；真菌（霉菌與酵母菌）數(shù)的分析使用馬丁孟加拉紅鏈霉素瓊脂培養(yǎng)基；乳酸菌數(shù)量的測定使用MRS 瓊脂培養(yǎng)基；雙歧桿菌數(shù)量的分析用BBL瓊脂培養(yǎng)基。具體配方參考趙斌等[4]的微生物學實驗進行。

1.1.3 試 劑熒光素二乙酸酯（Fluorescein diacetate，又稱3', 6'-二乙酰-熒光素，F(xiàn)DA）儲存液：2 mg FDA 和1 mL 丙酮，棕色瓶裝，-20 ℃避光保存；磷酸鹽緩沖液（pH 值7.6）：4.0 g NaCl、0.1 g KCl、0.27 g Na2HPO4、0.12 g KH2PO4溶于蒸餾水后定容至500 mL；DNS 液：稱取酒石酸鉀鈉91 g 溶于500 mL 蒸餾水中，在溶液中依次加入3.15 g 3,5-二硝基水楊酸和20 g NaOH，加熱攪拌使其溶解，再加入2.5 g 苯酚，2.5 g 無水Na2SO3，攪拌使之溶解，冷卻后定容至1 L，貯于棕色瓶中，放置一周后使用；0.4 mol/L TCA；福林酚試劑；0.4 mol/L NaOH 溶液；0.4 mol/L Na2CO3溶液；西紅柿浸出液；肝提取液。

1.2 儀器與設備

臺式大容量通用冷凍離心機（Eppendorf 5810R）、高壓滅菌鍋（YAMATO SQ510C）、電子天平（JA2003、YP- B2002）、氣浴恒溫振蕩器（SHZ-82）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH·BII·500-S）、電子恒溫水浴鍋（DZKW-4）、電熱恒溫水槽（SSW-420-2S）、可調(diào)式封閉電爐（FL-1）、純水儀（ELGA PC120COBPM1）、722 型可見分光光度計、78-1 型磁力加熱攪拌器等。

1.3 方 法

1.3.1 魚腸道內(nèi)容物的提取將采集的草魚和鯽魚用丁香酚麻醉后稱重、取樣，先用無菌棉花將體表水擦拭干凈，然后用沾有濃度為75%酒精的棉球擦拭魚體表面進行消毒，隨后采用無菌操作的方式用解剖剪從魚體肛門沿腹部向上剪開。待腹部完全剪開后，用鑷子剝離出魚的消化道，同時用沾有75%酒精的棉球擦拭消化道外壁。此后，用剪刀分離出中腸，采集各組的腸道內(nèi)容物，并將同種魚類的腸道內(nèi)容物進行稱重、混勻。以上操作具體參照汪明等[5]的方法、在無菌條件下進行。

1.3.2 魚腸道微生物數(shù)量的測定按組進行無菌操作[6]，稱取一定量的鯽魚和草魚腸道內(nèi)容物分別放入裝有25 粒左右玻璃珠和90 mL 無菌水的三角瓶中，分別編號為1、2，之后放入搖床中，轉(zhuǎn)速120 r/min振搖30 min，使微生物充分分散，待振蕩結(jié)束后，取出混合液，采用10 倍梯度稀釋法將菌液稀釋至10-6。待稀釋完畢后，選擇合適的稀釋度，采用稀釋涂布平板法進行。細菌在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后統(tǒng)計菌落數(shù)，真菌在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h 后統(tǒng)計菌落數(shù)，乳酸菌和雙歧桿菌均在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計菌落數(shù)，每一個稀釋度設置3 次重復，求其平均值，并據(jù)此計算出每克腸道內(nèi)容物中所含的菌數(shù)。

1.3.3 魚腸道酶活性的分析在無菌條件下，取出魚體內(nèi)的腸道內(nèi)容物、稱重，隨后將腸道內(nèi)容物用無菌水稀釋后裝瓶，放置于溫度為40 ℃的水浴鍋中保溫30 min，以充分溶出腸道內(nèi)容物中所含的酶蛋白，待冷卻，放入轉(zhuǎn)速為2 000 r/min 的離心機中離心10 min后，取上清液，即為腸道酶液，備用。測試時，吸取腸道酶液，分別滴加到標記為纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶的試管中，經(jīng)操作后測定上述4 種酶的活性，各設3 次重復。腸道纖維素酶活性、腸道淀粉酶活性以及腸道木聚糖酶活性的測定均采用DNS比色法進行，纖維素酶活以1 g 腸道內(nèi)容物中的酶在46 ℃作用30 min 生成1 μg 還原糖定義為一個酶活單位（U），淀粉酶活以1 g 腸道內(nèi)容物中的酶在37 ℃作用60 min生成1 μg還原糖定義為一個酶活單位（U），木聚糖酶活以1 g 腸道內(nèi)容物中的酶在46 ℃作用60 min 生成1 μg 還原糖定義為一個酶活單位（U）；蛋白酶活性的測定采用福林-酚法進行，以1 g 腸道內(nèi)容物中的酶在37 ℃作用40 min 生成1 μg 氨基酸定義為一個酶活單位（U）[6]。

1.3.4 魚腸道微生物活度測定利用1.3.3 提取的腸道酶液，根據(jù)微生物活度的內(nèi)涵，具體流程參照Schnürer J 和Rosswall T[7]的方法進行：取0.1 mL 濃度為2 mg/mL 的FDA 儲存液加入到19.9 mL 磷酸鹽緩沖液中，獲得濃度為10 μg/mL 的A 液，向 A 液中加入0.2 mL 腸道內(nèi)容物酶提取液，得到混合液，然后將混合液放入24 ℃的氣浴恒溫振蕩器中，振蕩培養(yǎng)90 min 后取出，并加入等體積的丙酮以終止反應。經(jīng)3 μm 濾紙過濾，放入6 000 r/min 離心機中離心5 min 后重新取出，在490 nm 測定OD 值，每個樣本重復測定3 次，記錄并分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 統(tǒng)計學分析用SPSS 21.00 軟件進行數(shù)據(jù)處理。各分組所得數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，兩組間均數(shù)比較若符合正態(tài)性、方差齊性則用獨立樣本t檢驗，否則采用非參數(shù)秩和檢驗。P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚和草魚的腸道微生物區(qū)系結(jié)果

微生物區(qū)系是特定環(huán)境中微生物的數(shù)量與種類的組成。由表1 可見，鯽魚和草魚腸道內(nèi)的細菌總數(shù)較接近，其中草魚腸道內(nèi)的真菌與雙歧桿菌數(shù)目均高于鯽魚，鯽魚腸道內(nèi)的乳酸菌數(shù)目高于草魚，但草魚腸道的各微生物數(shù)目與鯽魚相比差異無統(tǒng)計學意義（t細菌= -0.506，P細菌= 0.639；t真菌= -2.217，P真菌= 0.091；t乳酸菌= 3.692，P乳酸菌= 0.639；t雙歧桿菌=-0.420，P雙歧桿菌=0.696）。試驗中發(fā)現(xiàn)，真菌菌落結(jié)構顯示鯽魚和草魚的腸道真菌以青霉和曲霉等霉菌為主，幾乎沒有酵母菌（見圖1），而小鼠腸道中含有比較多的酵母菌[8]。

圖1 兩種魚類的腸道真菌菌落

表1 兩種魚類的腸道微生物區(qū)系結(jié)果

2.2 鯽魚和草魚的腸道主要消化酶活性特點

生物體的物質(zhì)轉(zhuǎn)化離不開酶的參與，從腸道消化酶的活性能直接反映機體消化能力以及間接反映腸道形態(tài)結(jié)構的完整性。由表2可見，鯽魚腸道內(nèi)的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和木聚糖酶活性均高于草魚。除草魚腸道內(nèi)的淀粉酶與鯽魚相比差異無統(tǒng)計學意義外（W淀粉酶= 47，P淀粉酶= 0.905 8），草魚腸道內(nèi)的蛋白酶、纖維素酶和木聚糖酶與鯽魚相比差異均有統(tǒng)計學意義，且存在極顯著差異（W蛋白酶= 21，P蛋白酶= 0.003 7；W纖維素酶=45，P纖維素酶= 0.000 3；W木聚糖酶= 45，P木聚糖酶= 0.000 3）。

2.3 鯽魚和草魚的腸道微生物活度

腸道微生物活度是腸道各類水解酶活性的總和，能夠反映腸道對物質(zhì)的水解情況。由表2 可見，草魚腸道內(nèi)的微生物活度明顯低于鯽魚腸道內(nèi)的微生物活度，與鯽魚相比差異有統(tǒng)計學意義，且差異極顯著（WFDA= 45，PFDA= 0.000 3）。

表2 兩種魚類的腸道主要消化酶活性及腸道微生物活度

3 討 論

3.1 鯽魚和草魚的腸道微生物區(qū)系特點

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法能夠?qū)μ囟ǖ目膳囵B(yǎng)微生物進行檢測，在腸道微生物數(shù)量的測定中也具有重要的意義[9-10]。隨著腸道微生物研究的深入，有關腸道微生物的應用必將關注可培養(yǎng)微生物。此研究發(fā)現(xiàn)草魚腸道內(nèi)霉菌數(shù)量明顯高于鯽魚腸道內(nèi)霉菌數(shù)量，而乳酸菌數(shù)量卻明顯低于鯽魚，這一發(fā)現(xiàn)與吳杰奇等[11]的研究結(jié)果一致。乳酸菌是動物腸道內(nèi)已知的益生菌，具有抑制病原菌的黏附、定植和入侵的作用，在腸道免疫方面發(fā)揮著重要的作用[3]，鯽魚腸道中乳酸菌的數(shù)量明顯高于草魚，這在一定程度上可解釋鯽魚抵抗能力強于草魚。草魚腸道中真菌數(shù)量較多可能與其攝入的食物種類有關，自然環(huán)境下，草葉、樹葉等真菌含量較高，為草魚腸道貢獻了部分外源性真菌。有研究學者采用18S ITS 高通量測序的方法研究用構樹葉投喂草魚腸道真菌群落多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，構樹葉組和配合飼料組腸道真菌群落結(jié)構有明顯差異[12]。

腸道菌群種類繁多，數(shù)量龐大。培養(yǎng)技術對腸道中有益微生物的產(chǎn)品研發(fā)提供了重要參考，為其分離和培養(yǎng)奠定了基礎。此研究使用的是可培養(yǎng)腸道微生物指標，但4 種可培養(yǎng)微生物的數(shù)目在兩種魚中差異并不顯著，說明兩種魚在魚病方面的差異很可能與其他的少數(shù)幾種微生物有關[13-15]。因此，借助微生物培養(yǎng)技術只能粗略反映特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下生長的腸道微生物特征。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展，采用高通量測序技術能更全面、更客觀地了解草魚和鯽魚腸道微生物特征[16]。

3.2 鯽魚和草魚腸道酶活性與食性的關系

腸道消化酶在營養(yǎng)物質(zhì)吸收，機體免疫等方面發(fā)揮著重要作用，根據(jù)來源分為內(nèi)源性消化酶和外源性消化酶。腸道微生物與消化酶有著重要的聯(lián)系，飼料中添加益生菌能夠提高魚類的消化酶活性，使一些難消化的大分子物質(zhì)分解成易被腸道細胞吸收的小分子物質(zhì)，進而利于魚類的生長[17]。一般而言，草食性魚類含有相對較高的纖維素酶活性和淀粉酶活性，雜食性魚類含有相對較高的蛋白酶活性和脂肪酶活性[18-19]。試驗結(jié)果顯示鯽魚的蛋白酶顯著高于草魚，與之前的一些研究結(jié)果相吻合。但草魚的淀粉酶和纖維素酶卻低于鯽魚，這一發(fā)現(xiàn)與一些研究結(jié)果相反。這可能與飼養(yǎng)環(huán)境、年齡等因素有關。例如在魚體生長后期，鯽魚和草魚的成魚均以植物性食料作為主要進食對象，故在一定程度上存在競爭關系[20]。此外，微生物活度的測定結(jié)果也與腸道酶活性的比較結(jié)果表現(xiàn)出一致性，猜測鯽魚在相同條件下迅速生長發(fā)育成成魚，即要求腸道內(nèi)的多種水解酶具有較強的活性，從而提高魚體對于飼料的利用率，以得到更多的水解產(chǎn)物，進而滿足自身對于生長繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì)的需求。腸道微生物與酶活性的關聯(lián)研究，對相關腸道調(diào)節(jié)劑的研發(fā)和使用具有較好的參考價值[21]。

4 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，鯽魚和草魚在腸道微生物及酶活性方面存在一定的差異，草食性為主的魚腸道內(nèi)真菌數(shù)目高于雜食性魚，而乳酸菌數(shù)目低于雜食性魚，雜食性魚腸道內(nèi)多種酶活性高于草食性魚。