一個(gè)高煙堿轉(zhuǎn)化烤煙株系的鑒定分析

田陽(yáng)陽(yáng)，軒貝貝，徐益群，楊繼周，劉 魁，王正旭，王軍偉，胡利偉

（1. 紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100；2. 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001）

煙草生物堿是煙草中重要的一類(lèi)化學(xué)成分，它不僅是煙草重要的品質(zhì)因素，而且是煙草商品的一種特質(zhì)。煙草屬中具有栽培價(jià)值的普通煙草（N.tabacum）和黃花煙草（N.rustica）均為煙堿積累型，通常情況下，煙堿占生物堿總量的90%～95%[1-2]。除煙堿外，煙草還含有其他次要生物堿，如降煙堿、新煙草堿、麥思明等[3-4]，這些次要生物堿也具有一定的生物活性，對(duì)煙草的品質(zhì)和安全性產(chǎn)生影響[5]。在煙草栽培品種的群體中，一些煙株因?yàn)榛蛲蛔儯哂薪禑焿A轉(zhuǎn)化為降煙堿的能力，導(dǎo)致煙葉煙堿含量顯著降低，降煙堿含量異常升高，這種由煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化并達(dá)到一定程度的煙株成為轉(zhuǎn)化株。

不同類(lèi)型的煙葉其生物堿含量和組成差異較大，白肋煙和馬里蘭煙等晾煙存在較為突出的煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化問(wèn)題，其轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化程度顯著高于烤煙，其原因可能與調(diào)制方式和轉(zhuǎn)化位點(diǎn)的數(shù)量和穩(wěn)定性有關(guān)。白肋煙轉(zhuǎn)化株外觀特征不明顯，烤煙轉(zhuǎn)化株烤后煙表面出現(xiàn)色度較強(qiáng)的紅色斑塊，斑塊上分布一些小顆粒狀物體[6-9]。Jeffrey 和Tso 最早報(bào)道具有此類(lèi)特征的煙葉，稱(chēng)其為“櫻紅”煙葉。Weybfew 等[2]的研究表明烤煙的高降煙堿含量與外觀的“櫻紅”現(xiàn)象相連鎖。對(duì)煙草中煙堿轉(zhuǎn)化性狀的遺傳機(jī)制研究表明，“櫻紅”煙葉主要由基因突變形成，煙堿和去甲基煙堿之間的轉(zhuǎn)化是由單一的顯性基因控制[10]。

筆者通過(guò)連續(xù)3 a 的跟蹤篩選，獲得一個(gè)具有高煙堿轉(zhuǎn)化的烤煙株系，其烤后煙葉能夠穩(wěn)定產(chǎn)生“櫻紅”現(xiàn)象。通過(guò)統(tǒng)計(jì)此株系在田間的農(nóng)藝性狀，檢測(cè)其煙堿、降煙堿和麥思明等生物堿的含量，并采用SNP 技術(shù)對(duì)其和相關(guān)煙草品種的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，明確其遺傳背景，為后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生機(jī)制解析及高煙堿煙葉對(duì)卷煙質(zhì)量影響評(píng)價(jià)提供材料和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017 年于玉溪市澄江縣田間篩選獲取轉(zhuǎn)化株種子，2018—2020 年連續(xù)3a 在澄江縣進(jìn)行代際跟蹤，對(duì)照品種選擇玉溪煙區(qū)主栽烤煙品種K326 和云87，大田管理及采烤技術(shù)參照玉溪當(dāng)?shù)貥?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)措施進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器

DNA marker，Taq 聚 合 酶、DL2000 Marker、脫氧核苷酸混合物均購(gòu)自于寶生物工程有限公司。熒光SSR 引物和Ezup 植物基因組 DNA 提取試劑盒和瓊脂粉等購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

3730XL DNA 分析儀（美國(guó)ABI 公司），超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司），NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher 公司）、5420 型微量離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）、Milli-Q 超純水處理儀（美國(guó)Millipore 公司）、電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）、PT100 型PCR 儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）、TM3030 臺(tái)式掃描電鏡（日立高新技術(shù)公司）、 GelDoc EZ 型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

1.3 葉面顯微觀察

將烤后煙葉剪成1 cm×2 cm 的小塊，然后采用雙面膠粘至樣品托表面。將TM3030 掃描電鏡和真空泵開(kāi)機(jī)，樣品腔抽取真空1～2 min 至Evac 燈長(zhǎng)亮即可進(jìn)行下一步，點(diǎn)擊Evac/Air 鍵放氣，等Air 鍵燈停止閃爍，黃燈長(zhǎng)亮?xí)r，拉開(kāi)樣品門(mén)，放置樣品托，同時(shí)根據(jù)情況適當(dāng)調(diào)整樣品托高度，然后關(guān)閉腔門(mén)，按Evac/Air 鍵抽真空，接著按AUTO 鍵進(jìn)行自動(dòng)對(duì)焦，并進(jìn)行拍照。

1.4 生物堿的檢測(cè)

將煙葉于38 ℃烘干粉碎，稱(chēng)取0.3 g 煙末，將其分裝入20 mL 螺口試管，使用移液器添加2.5 mL 氫氧化鈉溶液（5%），室溫放置15min，然后將20 mL三乙胺/甲基叔丁基醚溶液（0.01%）加入至管中，然后旋緊蓋子后超聲處理15 min，置于臺(tái)式高速離心機(jī)6000 轉(zhuǎn)/min 離心5min，從管中吸取有機(jī)相進(jìn)行GC/MS 分析，檢測(cè)各種生物堿的含量。

質(zhì)譜條件：電離電壓70 ev；溶劑延遲8 min；傳輸線(xiàn)溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；掃描方式選擇離子模式（SIM）。氣相色譜條件：色譜柱DB-35MS（30 m×0.25 mm i.d. ×0.25 μm d.f. ）；程序升溫100 ℃（3 min）然后以8 ℃/min 的升溫速度升溫至260 ℃（10 min）；載氣為氦氣；柱流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；生物堿的檢測(cè)：進(jìn)樣量1 μL，分流進(jìn)樣，分流比40 ∶1。

1.5 煙葉DNA 提取

煙葉基因組DNA 的提取采用Ezup 柱式植物基因組 DNA 提取試劑盒進(jìn)行，具體操作如下：將0.1 g的新鮮葉片在液氮中充分研磨成粉末，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL 的離心管中。加入600 μL 65℃預(yù)熱的Buffer PCB和12 μL β-巰基乙醇。震蕩混勻，置于65℃水浴25 min，間或混勻。加入600 μL 的氯仿，充分混勻，12 000 r/min 離心5 min。吸取上層水相至一個(gè)干凈的1.5 mL 的離心管中。加入與上層水相等體積Buffer BD，顛倒混勻3 ～5 次，再加與上層水相等體積的無(wú)水乙醇，充分混勻后用移液器將其全部加入到吸附柱中，室溫靜置2 min。10 000 r/min 離心1 min，倒掉收集管中廢液。將吸附柱放回收集管中，加入500 μL PW Solution，10 000 r/min 離心1 min，倒掉收集管中廢液。將吸附柱放回收集管中，加入500 μL Wash Solution，10 000 r/min 離心1 min，倒掉收集管中廢液。將吸附柱放回收集管中，12 000 r/min 離心2 min。取出吸附柱，放入一個(gè)新的1.5 mL 離心管中，在吸附膜中央加入50 μL TE Buffer，靜置3 min，12 000 r/min 離心2 min，使用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000 檢測(cè)煙葉DNA濃度與純度，將DNA 樣品貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 全基因組SNP 分析

利用 430 k Tobacco SNP array（美國(guó) Affymetrix 公司）對(duì)TS01 和其他36 個(gè)煙草品種進(jìn)行全基因組掃描，依托 國(guó) 家 煙 草 基 因 研 究 中 心 Gene Titan 芯 片（美國(guó) Affymetrix 公司）平 臺(tái) 進(jìn) 行 樣 本 DNA 的 SNP 分 型，具體操作參考張劍鋒等[11]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙堿轉(zhuǎn)化株TS01 農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

在農(nóng)藝性狀方面，TS01 與K326 株型都表現(xiàn)為筒型，但葉面形態(tài)存在較大差異，TS01 葉面較平整且葉緣內(nèi)扣，K326 葉面相對(duì)皺縮，TS01 葉耳較K326稍大（圖1）。TS01 在烘烤后其外觀特征表現(xiàn)為葉面出現(xiàn)色度較強(qiáng)的深紅色或棕紅色斑塊，斑塊上有明顯小顆粒狀物體，聞香較為突出（圖2）。

圖1 TS01 與K326 新鮮煙葉形態(tài)特征

圖2 TS01 與K326 烤后煙葉形態(tài)特征

在田煙和地?zé)煼N植區(qū)域，TS01 的平均株高均低于K326，TS01 在田煙和地?zé)煹闹旮叻謩e為107.9 cm和98.8 cm，K326 分別為112.5 cm 和101.0 cm；TS01打頂后有效葉片數(shù)少于K326，田煙平均少1 片，地?zé)熎骄? 片左右；TS01 節(jié)距略小于K326（表2）。

表2 TS01 與K326 的農(nóng)藝性狀比較

2.2 煙堿轉(zhuǎn)化株TS01 的表面微觀特征

K326 和TS01 的顯微掃描照片都能夠清晰顯示細(xì)胞的邊界、氣孔、纖毛等，前者細(xì)胞排列整齊平滑，纖毛凸起干癟，而TS01 煙葉細(xì)胞皺縮嚴(yán)重，表面高低不平，個(gè)別區(qū)域變形嚴(yán)重，細(xì)胞邊界清晰，中心有凸起感，色彩稍深，細(xì)胞邊界色澤稍淺，細(xì)胞中心位置與細(xì)胞邊緣色澤有較大差異，纖毛數(shù)量與K326 比并無(wú)明顯差異，氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞陷入葉面中（圖3）。

圖3 TS01 和K326 中部葉的顯微掃描

2.3 煙堿轉(zhuǎn)化株TS01 的生物堿含量

TS01 生物堿各組分含量與K326 和云煙87 存在非常大的差異，其中K326 和云煙87 的煙堿含量分別是總生物堿的97.40%和96.91%，而TS01 則只有6.26%。降煙堿占總生物堿的比值，TS01 是90.78%，K326 和云煙87 則為1.56%和1.72%。麥思明和N-甲酰基降煙堿在TS01 中含量也較高，占總生物堿比值分別為0.86%和0.11%，而K326 和云煙87 中麥思明占總生物堿的比值在0.03%左右，N-甲酰基降煙堿占總生物堿的比值在0.003%左右（圖4）。假木賊堿、新煙草堿、煙堿烯等其他生物堿的含量TS01、云煙87 及K326 之間有一定差異，但是差異倍數(shù)較小。與K326 相比，TS01 中假木賊堿增加了1.77 倍，新煙草堿增加了1.82 倍，而煙堿烯減少了49.74%。與云煙87 相比，TS01 中假木賊堿增加了1.53 倍，新煙草堿增加了1.5 倍，而煙堿烯減少了48.11%。可的寧含量三者之間沒(méi)有明顯差異。TS01 株系的煙堿轉(zhuǎn)化率都在93%以上，而云煙87 和K326 煙堿轉(zhuǎn)化率在2%以下，說(shuō)明TS01 是一個(gè)具有極高煙堿轉(zhuǎn)化率的烤煙株系。

圖4 TS01 與K326、云煙87 主要生物堿含量對(duì)比

2.4 TS01 的遺傳背景分析

利用煙草高密度SNP 芯片技術(shù)對(duì)TS01 和其他36 個(gè)煙草品種進(jìn)行全基因組掃描，結(jié)果見(jiàn)表3。其中與TS01 遺傳距離在0.1 以下的有2 個(gè)品種：云煙85和畢納1 號(hào)。 在0.1～0.2 的有12 個(gè)品種，包括K326、云煙116、NC55 等。在0.2～0.3 的有KRK26、龍江981、豫煙6 號(hào)、云煙105、云煙100 等5 個(gè)品種，在0.3 以上的有TI245、中煙100、NC89 等17 個(gè)品種。

表3 TS01 與其他36 個(gè)煙草品種的SNP 分析比較

3 小結(jié)與討論

TS01 大田生長(zhǎng)株型為筒形，葉面較平整，葉耳稍大。烤后煙葉紅色朱砂斑，色度較強(qiáng)的深紅色或棕紅色斑塊，斑塊上有明顯小顆粒狀物體，聞香較為突出。TS01 煙堿轉(zhuǎn)化率都達(dá)到了93%以上，其中降煙堿，麥思明，N-甲基降煙堿含量極高，煙堿含量顯著降低，SNP 遺傳進(jìn)化分析表明其與云煙85、畢納1號(hào)等親緣關(guān)系較近，為后續(xù)進(jìn)行煙堿轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生機(jī)理解析，以及研究高煙堿轉(zhuǎn)化率煙葉對(duì)卷煙產(chǎn)品煙氣特征的影響提供了穩(wěn)定的研究材料和背景數(shù)據(jù)。

煙堿含量異常增高的突變株，烘烤后的煙葉呈現(xiàn)櫻桃紅色。這種煙葉一般高降煙堿含量與外觀的“櫻紅”現(xiàn)象相連鎖[12-14]，對(duì)煙草中煙堿轉(zhuǎn)化性狀的遺傳機(jī)制研究表明，煙堿和去甲基煙堿之間的轉(zhuǎn)化是由單一的顯性基因控制[15-17]，遺傳穩(wěn)定性的研究表明，高轉(zhuǎn)化性狀較為穩(wěn)定，而低轉(zhuǎn)化性狀易發(fā)生突變[18-20]。TS01 的株高比K326 稍低，但并無(wú)太大差異，說(shuō)明煙堿和降煙堿等都為次生代謝物，并不嚴(yán)重影響煙株的生長(zhǎng)等生理過(guò)程。

TS01 烤后煙葉煙堿含量顯著降低，而降煙堿、麥思明、N-甲基降煙堿含量均明顯提高，說(shuō)明TS01中從煙堿到降煙堿、麥思明、N-甲基降煙堿的代謝通路的酶活較高，基因可能出現(xiàn)一定程度的正向突變。有研究表明，P450 家族基因CYP82E4v1和CYP82E5v2等基因參與了煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化[21-23]，CYP82E5v2在鮮葉中特異表達(dá)，CYP82ElO在根部特異表達(dá)，CYP82E4vl主要在衰老葉片中及幼苗和成株的莖中表達(dá)，在根中幾乎不表達(dá)，是煙堿轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，這些基因同源性較高。高表達(dá)CYP82E4v1的植株其煙堿轉(zhuǎn)化率達(dá)到了97%以上，TS01 中煙堿轉(zhuǎn)化率也在93%以上，至于CYP82E4v1是否也在TS01中出現(xiàn)了超高的表達(dá)，還需要進(jìn)一步研究。

研究人員以白肋煙TN90 為材料的研究表明，隨著煙株煙堿轉(zhuǎn)化能力的提高和煙葉降煙堿含量的增加，葉片和主脈的麥思明含量呈線(xiàn)性增加。當(dāng)煙堿轉(zhuǎn)化率超過(guò)20%時(shí)，麥思明含量超過(guò)了假木賊堿的含量[24-26]。而TS01中麥思明含量也已經(jīng)超過(guò)了假木賊堿，其含量的提高究竟是否由于高含量降煙堿而出現(xiàn)的變化，另外N-甲基降煙堿的含量增加是否也是因?yàn)檫@個(gè)原因，還需要更多的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)SNP 研究了TS01 與36 個(gè)煙草品種之間的關(guān)系，結(jié)果顯示其與云煙85 親緣關(guān)系最近，接著為畢納1 號(hào)與K326，印證了其很大可能來(lái)自于云煙85，可能是云煙85 的自然突變株，完全確定則需要通過(guò)全基因組測(cè)序進(jìn)行比對(duì)分析。