重慶地區淫羊藿HPLC 指紋圖譜研究

朱學棟，許 攀，張曉芳，朱菲菲，何曉蓉

（重慶市渝東南農業科學院，重慶 400800）

淫羊藿是我國傳統大宗中藥材，為小檗科淫羊藿屬多年生常綠草本植物。地上干燥部分入藥，其主要化學成分為多種黃酮類有機化合物、木脂素、生物堿、揮發油等。具有調節人體內激素分泌、增強人體自身細胞免疫能力等重要生理作用[1-2]，廣泛用于補腎壯陽、強壯筋骨、祛寒散濕等方面，現代中醫藥研究表明，淫羊藿具有良好的保健、抗癌抗腫瘤效果[3]。全球淫羊藿屬植物約56 種，我國約47 種[4]，占全世界淫羊藿屬植物資源的83.93%，因此，我國是淫羊藿種質資源最豐富的國家，也是該屬植物的現代地理分布中心。但《中國藥典》規定藥用淫羊藿品種僅為心葉淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、朝鮮淫羊藿和巫山淫羊藿的地上干燥部分[5]。其中，心葉淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、朝鮮淫羊藿植物總黃酮含量一般不低于5.0%，淫羊藿苷含量不得低于0.5%；巫山淫羊藿朝藿定C 成分含量一般不低于1.0%。我國淫羊藿產區現階段還主要以野生資源為主，隨著淫羊藿需求量大增，藥民采用連根拔起的方式挖掘，導致野生資源銳減，質量參差不齊，在臨床用藥方面極不規范。

中藥材指紋圖譜能有效識別藥材的真偽或產地，通過其主要特征峰的面積大小或比例限定，能有效控制藥材質量。因此，筆者以重慶三峽庫區的野生淫羊藿種質資源為研究對象，通過液相色譜峰的保留時間和峰面積構建當地野生淫羊藿種質資源的指紋圖譜，為庫區淫羊藿種質資源的開發利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試中藥材供試中藥材種類為淫羊藿，主要收集于重慶三峽庫區，共20份淫羊藿野生種質資源（詳見表1）。

1.1.2 試驗儀器Agilent 1260 高效液相色譜儀 （包括：真空脫氣機、二元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD 檢測器，美國），KQ2200DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），FA114 萬分之一電子天平（上海豪晟科學儀器有限公司）。

1.1.3 試 劑淫羊藿苷對照品（批號：PCS-190218，購于北京世紀奧科生物技術有限公司，質量分數≥98%）；乙腈（色譜純，上海星可高純溶劑有限公司）；乙醇、甲醇（色譜純，成都市科隆化學品有限公司）；流動相用水為實驗室純水機制取超純水（賽默飛Direct-Qr3UV）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水（30 ∶70）為流動相，檢測波長為270 nm，進樣量10 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備取淫羊藿苷標準品適量，精確稱量，加甲醇溶液制成0.1 mg/mL 的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備取供試品粉末（過50 目篩）0.2 g，精密稱定，轉移到帶塞錐形瓶中，加入稀乙醇溶液20 mL，稱定重量，超聲處理1 h，再稱定濾液重量，用稀乙醇補足缺失重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

1.2.4 方法學考察（1）精密度試驗：精密吸取同一供試樣品，按照1.2.1 色譜條件進行方法精密度測定，連續進樣5 次，考察保留時間和峰面積，計算RSD。（2）穩定性試驗：精密吸取同一供試樣品，按照1.2.1 色譜條件進行方法穩定性測試，樣品分別放置1、2、4、8、24 h 后依次進樣，分別考察保留時間和峰面積，計算得出RSD。（3）復性試驗：按照1.2.3 制備5 份供試樣品，再按照1.2.1的檢測方法檢測保留時間和峰面積，計算RSD。

1.2.5 主成分分析與聚類分析（1）主成分分析：以淫羊藿內含有機化合物的峰面積大小為主要變量，利用SPSS 統計分析軟件對淫羊藿主成分進行分析。（2）聚類分析：通過SPSS 統計軟件中Ward 聯接聚類方法，利用 Euclidean 等距離測量分析技術，對20 份淫羊藿樣品的液相色譜數據進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

精密度試驗結果顯示，RSD 為0.87%，小于3%，表明該方法精密度良好，符合指紋圖譜構建的相關技術要求。穩定性試驗結果顯示，RSD為1.01%，小于3%，說明樣品穩定性良好，符合指紋圖譜構建的相關技術要求。重復性試驗結果顯示，RSD 小于3%，表明該方法重復性良好，符合指紋圖譜構建的相關技術要求。

2.2 指紋圖譜構建

由表2 可知，峰面積RSD 差異較大，從1～11 號峰的RSD 分別為5.06%、249.2%、161.9%、80.1%、52.5%、57.7%、91.9%、138.1%、126.5%、62.8% 和117.1%，其中，2 號峰的RSD 最大，1 號峰RSD 最小。這表明不同品種不同地點收集的淫羊藿種質資源具有較大的差異性；其中1、4、5、6、8、9、10、11 號峰為20 份種質資源的共有峰。

表2 不同批次淫羊藿種質資源的峰面積

2.3 主成分分析與聚類分析

2.3.1 主成分分析如圖1 所示，20 份淫羊藿種質資源中共檢測出11 種成分，其中有4 個峰貢獻率較大，特征值均超過1。

圖1 20 份淫羊藿種質資源主成分分析結果

2.3.2 聚類分析聚類結果如圖2 所示，20 份淫羊藿主要可分為3 大類，第一類為編號3、20、15、1、12、2、6 的樣品，第2 類為編號8、14、7、4、5、9、10、11、13 的樣品，第3 類為編號17、18、19、16 的樣品。

圖2 20 份淫羊藿種質資源聚類分析結果

3 結 論

通過收集重慶本地淫羊藿野生種質資源，以淫羊藿苷為標樣，按照《中國藥典》標準進行洗脫分離，該方法穩定，重現性好。構建得到重慶地區淫羊藿HPLC 指紋圖譜。結果表明，不同收集地點，不同品種淫羊藿藥材差異性較大，同一地點，同一品種之間相似性較高，且各品種之間有效藥用成分含量差異大，同品種不同地點有效成分含量也有存在較大的差異性。因此，不同淫羊藿種質資源，通過更多優良的特異性狀來區別對待[6]。通過指紋圖譜建立，為更好地控制淫羊藿中藥材內在質量提供科學依據，逐步規范淫羊藿用藥，保護淫羊藿野生種質資源。