羊小反芻獸疫抗體比對(duì)實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)

閆會(huì)章，楊聰偉

（饒陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北饒陽 053900）

小反芻獸疫俗稱羊瘟，又名小反芻獸假性羊瘟、肺腸炎、口炎肺腸炎復(fù)合癥，本病是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性、接觸性傳染疾病，主要感染小反芻動(dòng)物（特別是山羊和綿羊易感染），以發(fā)病急劇、高熱稽留、眼鼻分泌物增加、口炎、腹瀉和肺炎為特征。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將本病定為A類疾病。發(fā)病率一般高達(dá)100%，嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá)100%，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的健康發(fā)展.為科學(xué)評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果及其免疫抗體持續(xù)期，確保全縣養(yǎng)羊業(yè)健康、穩(wěn)定、持續(xù)發(fā)展，在我縣采集部分（河北唯尊養(yǎng)殖有限公司、饒陽眾悅羊場(chǎng)、饒陽佳浩家庭農(nóng)場(chǎng)、饒陽寅興羊場(chǎng)、饒陽王寧養(yǎng)殖場(chǎng)等羊場(chǎng)）免疫羊全血，并分離出血清，用阻斷ELISA方法檢測(cè)小反芻獸疫抗體。結(jié)果表明：全縣小反芻獸疫免疫效果較好，免疫質(zhì)量高；小反芻獸疫疫苗抗體持續(xù)時(shí)間至少達(dá)13個(gè)月以上，小反芻獸疫疫苗具有良好的免疫原性，可產(chǎn)生良好的免疫效果。現(xiàn)將羊小反芻獸疫抗體比對(duì)實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)及操作步驟介紹如下：

河北唯尊養(yǎng)殖有限公司、饒陽眾悅羊場(chǎng)、饒陽佳浩家庭農(nóng)場(chǎng)、饒陽寅興羊場(chǎng)、饒陽王寧養(yǎng)殖場(chǎng)這5個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)均免疫過羊小反芻獸疫疫苗，且末次免疫日期都在21天以上，每個(gè)羊場(chǎng)采血15份，每份羊全血采自一只羊，分離出血清備用。

羊小反芻獸疫抗體檢測(cè)的方法：小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。

生產(chǎn)日期：2019.10.25

批準(zhǔn)文號(hào)：020171912

有效期至：2020.10.25

保存方式：2℃～8℃保存

試劑廠家：青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心。

需自備的試驗(yàn)用器材：96孔板、100微升及200微升的單道或多道移液器、吸頭、酶標(biāo)儀、生物安全柜、純水或去離子水。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑盒在使用前必須恢復(fù)至室溫（20℃～25℃），加液前充分搖勻。整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。陰性血清、羊小反芻獸疫陽性血清、樣品稀釋液和樣品的分布如圖所示，陰性對(duì)照（N）、陽性對(duì)照（P）、樣品稀釋液對(duì)照（Cm）和待檢血清（S）所示：

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N S3 B N S4 C P D P E cm F cm G S1 H S2

1 做實(shí)驗(yàn)時(shí)的注意事項(xiàng)

1.1 試劑盒在使用前必須恢復(fù)至室溫（20℃～25℃），加液前充分搖勻。

1.2 需稀釋的組分洗滌液20倍在稀釋時(shí)應(yīng)準(zhǔn)確量取，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶應(yīng)加熱使其溶解后使用。

1.3 底物溶液應(yīng)注意避光保存。

1.4 在操作過程中，盡量避免將氣泡加入檢測(cè)孔中。

1.5 終止液為稀硫酸溶液避免接觸到皮膚或眼睛。

2 羊小反芻獸疫抗體比對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作步驟

羊小反芻獸疫抗原包被板上羊小反芻獸疫操作步驟：

2.1 在A1和B1孔加入羊小反芻獸疫陰性血清各50微升；

2.2 在C1和D1孔加入羊小反芻獸疫陽性血清各50微升；

2.3 在E1和F1孔加入樣品稀釋液各50微升；

2.4 剩余孔加入25微升樣品稀釋液，然后加入25微升樣品用于檢測(cè)；

2.5 輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），37℃孵育60分鐘；

2.6 將洗滌液20倍用純水或去離子水做20倍稀釋，即為工作濃度的洗滌液1倍；

2.7 甩干羊小反芻獸疫抗原包被板孔中的液體，每孔加入300微升洗滌液1倍，洗滌4次，在洗滌和加入下一個(gè)試劑前，避免孔壁變干；

2.8 將酶標(biāo)抗體5倍用樣品稀釋液做5倍稀釋，即為工作濃度的酶標(biāo)抗體1倍；每孔加入50微升的酶標(biāo)抗體1倍；

2.9 37℃孵育30分鐘；

2.10 甩干羊小反芻獸疫抗原包被板孔中的液體，每孔加入300微升洗滌液1倍，洗滌4次，在洗滌和加入下一個(gè)試劑前，避免孔壁變干；

2.11 每孔加入50微升底物溶液；

2.12 室溫下避光孵育15分鐘；

2.13 每孔加入50微升的終止液終止顯色反應(yīng)；

2.14 使用酶標(biāo)儀測(cè)定450納米波長(zhǎng)處的OD值。

通過結(jié)果計(jì)算得出以下對(duì)比結(jié)果：

5個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)抗體檢測(cè)結(jié)果顯示

通過對(duì)比試驗(yàn)得知，小反芻獸疫疫苗具有良好的免疫原性，抗體合格率高，抗體維持時(shí)間長(zhǎng)，可產(chǎn)生良好的免疫效果；鑒于本病發(fā)病率高，致死率高，得病后無特效的治療方法，所以建議養(yǎng)殖戶在羊群健康時(shí)非常有必要作此免疫，以降低該病的發(fā)生。