無機砷短期脅迫對銅藻幼苗氧化損傷、抗氧化酶及抗氧化物的影響

張鵬，劉瑋，王鐵桿，鐘晨輝，陶月良

1.浙江省海洋水產養殖研究所/浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，浙江 溫州 325000；2.山東省海洋生物研究院藻類研究中心，山東 青島 266104；3.福建省水產研究所/福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361000；4.溫州大學生命與環境科學學院，浙江 溫州 325000

砷污染是目前世界關注重要環境問題，其來源主要為礦業采掘、農藥施用及化石燃料等途徑（Basu et al.，2001）。砷污染的危害較為深遠，砷化物不僅本身具有一定毒性（朱濛等，2020），而且其能在生物體內積累，并可通過食物鏈傳遞、富集，從而產生廣泛危害（Nakajima et al.，2010；杜森等，2019；趙寧寧等，2019）。目前中國是受砷污染較為嚴重的國家之一，地表水體被砷污染的現象較為突出（楊婉玲等，2015），經由地表徑流，近岸海域也是受砷污染影響的重要區域（胡立成等，2017）。在近岸海域分布的大型海藻體內已發現有砷富集現象，尤其在墨角藻目海藻中無機砷積累較為明顯（Koch et al.，2007；楊承虎等，2017），這表明大型海藻對砷脅迫具有一定耐受性。通常砷脅迫會導致生物體內嚴重的過氧化損傷，這不僅會激活生物體內抗氧化酶系統應對脅迫產生的過量活性氧（Basu et al.，2001；Flora，2011），而且在植物中以NPT為代表的抗氧化物能夠絡合砷離子，通過絡合物轉運區隔，以減輕脅迫效應（史靜等，2015；馬思思等，2020）。但在大型海藻中無機砷脅迫能對藻體產生何種影響，且藻體如何應對無機砷脅迫目前并不清楚。

銅藻（Sargassum horneri）隸屬于褐藻門、墨角藻目、馬尾藻科，是近岸海藻場構建的重要種類。近年來隨著漂浮銅藻的出現，針對銅藻提取物體外抗氧化活性相關研究逐漸受到關注（袁付紅等，2019；張玉等，2018；鄭麗杰等，2020），但對于銅藻體內抗氧化系統的研究相對較少。有研究發現相較于海帶、裙帶等大型海藻，銅藻能夠富集更高濃度的無機砷（陳露等，2020），但在砷脅迫條件下銅藻抗氧化系統的脅迫應對機制并不清楚。因此以銅藻為目標海藻開展砷脅迫條件下的生理研究，有利于深入了解大型海藻應對外源砷脅迫的抗逆生理特點。本研究以銅藻為研究對象，探討了不同價態、濃度的無機砷（As3+、As5+）短期脅迫下，海藻體內氧化損傷、抗氧化酶及抗氧化物等生理指標的響應情況，為揭示銅藻砷脅迫下抗氧化系統調節機制提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗樣品為人工繁育的銅藻幼苗，種菜來自浙江南麂島（27°27′N，121°03′E）。幼苗在室內懸浮培養，培養溫度18 ℃，光照強度2400 lx，光照周期為光照12 h，黑暗12 h。培養基采用鹽度30的滅菌海水配制的PES培養基，每5天更換1次培養液。選取藻體長度3 cm的健康幼苗用于試驗。

1.2 砷濃度實驗組設置

砷濃度實驗組分為As3+和As5+實驗組，在培養基中分別添加NaAsO2、Na2HAsO4·7H2O獲得As3+和As5+的濃度梯度實驗組。鑒于銅藻砷富集能力較強（陳露等，2020），為獲得銅藻砷脅迫下的半效應濃度本研究實驗設置了較高的砷脅迫濃度，As3+和As5+的濃度梯度分別設置為0、50、100、150、200 mmol·L?1。將實驗藻體用滅菌海水沖洗后，分別轉入帶有2 L培養基的3 L的三角瓶中進行充氣懸浮培養；各實驗組設置3個重復，每個重復包含30株幼苗。藻體脅迫處理24 h后取出，先用滅菌海水沖洗，再用去離子水反復沖洗，待拭干藻體表面水分后，進行后續生理指標測定。

1.3 生理指標測定

以相對電導率為指標衡量銅藻幼苗細胞損傷率。RC測定時稱取0.5 g海藻幼苗，放入帶有15 mL去離子水（電導率<0.1 US·cm?1）的試管中，18 ℃下，在 200 r·min?1的搖床上振蕩 2 h，隨即測定溶液電導率 C1。隨后沸水浴 30 min，再在 200 r·min?1的搖床上振蕩 2 h，待冷卻至 18 ℃后測定溶液電導率C2，設置3次重復。相對電導率計算公式如下：

氧化損傷指標（OFR、MDA）、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）及抗氧化物含量（GSH、NPT）的測定使用上海酶聯生物公司的相關試劑盒進行測定，測定時取 0.2 g藻體液氮研磨后作為待測樣品進行分析。

1.4 數據分析

不同砷濃度實驗組比較采用單因素方差分析，其組間比較采用LSD法，不同價態砷實驗組比較采用t檢驗，顯著性水平為α=0.05。方差分析及主成分分析過程由SPSS Statistics 23.0軟件完成，銅藻幼苗半效應濃度（EC50）采用Logistic方程法（段美紅等，2020）計算獲得，對相對電導率數據進行Logistic非線性擬合，其擬合方程為：

式中，y為相對電導率值代表細胞傷害率；x為實驗組砷濃度；a為細胞傷害率飽和量，b、k為方程系數。半效應濃度（EC50）計算公式為：

2 結果

2.1 砷脅迫下相對電導率變化及半效應濃度的確定

不同濃度砷脅迫下藻體電導率變化如圖 1所示，隨著砷濃度增加藻體電導率顯著提高（P=0.000，α<0.05，下同）。As3+實驗組中，當濃度由 50 mmol·L?1升高至 200 mmol·L?1時，藻體相對電導率由(54.5%±5.0%) 提高至 (95.5%±3.5%)；同樣在 As5+實驗組中，藻體相對電導率也由 (32.4%±3.8%) 逐漸提高至 (91.4%±3.7%)。總體上，不同價態砷實驗組的電導率差異不顯著。但兩兩比較發現，在 50 mmol·L?1及 100 mmol·L?1濃度時不同價態砷實驗組間 存 在 顯 著 差 異 （ 50 mmol·L?1P=0.007 ， 100 mmol·L?1P=0.001），且 As3+實驗組的相對電導率高于As5+實驗組。

圖1 不同濃度砷脅迫下銅藻相對電導率Fig.1 Relative conductivity changes of S.horneri under different concentrations of arsenic stress

分別對不同價態砷實驗組電導率進行 Logistic曲線擬合（圖 2），其中 As3+實驗組曲線回歸系數（r2=0.757）優于 As5+實驗組曲線回歸系數（r2=0.661）。曲線分析發現，在 0—100 mmol·L?1濃度區間時，As3+實驗組相對電導率迅速上升，而As5+實驗組相對電導率則上升相對遲緩；在 100—200 mmol·L?1濃度區間時，As3+實驗組相對電導率已達到平臺期，而 As5+實驗組相對電導率仍呈上升趨勢。As5+實驗組 EC50值為 116.3 mmol·L?1，而 As3+實驗組 EC50值僅為 50.1 mmol·L?1，兩者比值為2.3∶1。

圖2 銅藻相對電導率的Logistic擬合曲線Fig.2 Logistic fitting curves based on relative conductivity of S.horneri

2.2 砷脅迫下OFR與MDA變化

砷濃度對銅藻 OFR產生速率影響顯著（P=0.000）（圖3），As3+、As5+實驗組的 OFR產生速率均隨砷濃度上升而提高。對比不同價態砷實驗組發現，雖然As3+實驗組OFR產生速率比As5+實驗組更早到達平臺期，但不同價態砷實驗組OFR產生速率總體差異未達到顯著水平（P=0.196），且相同濃度下As3+、As5+實驗組差異也不明顯。

圖3 不同砷濃度下銅藻OFR和MDA變化情況Fig.3 Variation of OFR and MDA in S.horneri under different concentrations of arsenic

藻體內 MDA含量受砷脅迫濃度變化明顯（P=0.000）。As3+實驗組隨砷濃度上升，MDA含量迅速提高并在100 mmol·L?1濃度時達到相對穩定狀態；As5+實驗組MDA含量隨砷濃度上升較為遲緩，在 150 mmol·L?1時 MDA 含量才達到相對穩定狀態。不同價態實驗組MDA含量最大值均出現在200 mmol·L?1時，但差異并不明顯（P=0.125）。雖然在50 mmol·L?1及 100 mmol·L?1濃度時 As3+、As5+實驗組MDA含量存在明顯差異（50 mmol·L?1P=0.011，100 mmol·L?1P=0.004），但總體上不同價態實驗組MDA含量差異未達到顯著水平（P=0.274）。

2.3 砷脅迫對抗氧化酶系統的影響

砷脅迫濃度對 SOD活性產生了明顯影響（P=0.000）（圖4）。As3+實驗組隨著砷濃度上升SOD活性首先顯著上升，并在As3+100 mmol·L?1時達到酶活最大值 (25.6±2.1) U·g?1，隨后 SOD 活性隨砷濃度上升呈不明顯的下降趨勢。As5+實驗組在 0—150 mmol·L?1范圍時，SOD活性隨砷濃度上升而持續升高；150—200 mmol·L?1范圍時，SOD 活性變化并不明顯（P=0.850）。砷脅迫濃度對POD活性的影響也達到顯著水平（P=0.000），在 0—100 mmol·L?1范圍時，隨砷濃度上升 As3+、As5+實驗組POD 活性均明顯提高；在 100—200 mmol·L?1范圍時，As3+、As5+實驗組POD活性變化均不顯著。不同于SOD和POD，CAT活性對砷脅迫濃度變化并未產生明顯響應（P=0.270）。

圖4 不同砷濃度下SOD、POD和CAT的活性變化Fig.4 Activities of SOD,POD and CAT varied in S.horneri under different concentrations of arsenic

對不同價態實驗組對比發現，100 mmol·L?1濃度時As3+實驗組SOD活性、POD活性均明顯高于As5+實驗組酶活性（SOD P=0.000，POD P=0.000），但總體上不同價態實驗組SOD、POD、CAT活性差異均不明顯（SOD P=0.087，POD P=0.218，CAT P=0.777）。

2.4 砷脅迫下GSH和NPT變化

GSH含量、NPT含量均受砷脅迫濃度顯著影響（圖 5），在 0—50 mmol·L?1范圍時，As3+、As5+實驗組GSH含量與NPT含量均隨砷脅迫濃度增加而顯著上升。在 50—150 mmol·L?1范圍時，As3+、As5+實驗組 GSH含量變化并不明顯，As5+實驗組 NPT含量變化也不顯著，但 As3+實驗組 NPT含量呈下降趨勢，且（As3+）150 mmol·L?1時 NPT 含量明顯低于（As3+）50 mmol·L?1時的值（P=0.011）。在 50—150 mmol·L?1范圍時，As3+、As5+實驗組 GSH 含量與NPT含量雖有下降趨勢，但變化并不顯著。

圖5 不同砷濃度下GSH和NPT的濃度變化Fig.5 Variations of GSH and NPT content in S.horneri under different concentrations of arsenic

相同砷濃度時不同價態實驗組兩兩對比發現，GSH含量均無明顯差異，NPT含量僅在砷脅迫濃度為 50 mmol·L?1時存在明顯差異（P=0.021）。GSH 含量、NPT含量各自在不同價態實驗組間總體差異不顯著。

2.5 抗氧化指標主成分分析及綜合排序

對所有實驗組的5個抗氧化生理指標（SOD、POD、CAT、GSH、NPT）進行主成分分析，共提取到2個主成分，其貢獻率分別為55.325%、29.535%，累計貢獻率達84.860%，且兩個主成分特征值均大于1。兩個主成分表達式分別為：

Y1、Y2為主成分，x1、x2、x3、x4、x5分別代表SOD、POD、CAT、GSH、NPT的標準化值。主成分1中NPT、GSH、POD、SOD的系數較大，是反映抗氧化物（NPT、GSH）和抗氧化酶（POD、SOD）的綜合指標；主成分2中CAT的系數較大，主要反映了CAT指標。通過貢獻率對主成分值加權對各實驗組銅藻抗氧化綜合得分情況進行排序，結果見表1。排名前 3 位的是實驗組為（As5+）100 mmol·L?1、（As3+）50 mmol·L?1、（As5+）150 mmol·L?1。在 As3+實驗組中，隨著濃度的升高，銅藻抗氧化綜合得分呈下降趨勢；而在As5+實驗組中，隨著濃度的升高，銅藻抗氧化綜合得分則呈先上升后下降趨勢。

表1 砷脅迫實驗組抗氧化綜合得分排序Table 1 Ranking arsenic stress treatments with antioxidant comprehensive score

3 討論

3.1 砷脅迫對銅藻細胞損傷的影響

砷作為一種植物非營養元素本身具有一定的生物毒性并可在海藻體內富集（Nakajima et al.，2010；陳露等，2020），并對細胞產生多種氧化損傷影響正常生長（Rao et al.，2004；Flora，2011）。砷脅迫條件下可誘導產生過量的活性氧（Hei et al.，2004），由此導致細胞膜脂質發生過氧化損傷，其中MDA不僅是膜脂中不飽和脂肪酸的過氧化產物，還是反映脂質過氧化程度的重要指標（陳貴等，1991；Cooper et al.，2009）。當具有通路作用的細胞膜脂質損傷加劇后會導致細胞透性變化，甚至細胞膜破損、胞質流出造成細胞死亡（Ferreri et al.，2007；范寧波等，2020）。本研究發現，不同價態的砷脅迫均能導致銅藻體內 OFR產生速率提高，且 As3+、As5+砷脅迫濃度對藻體內 OFR產生速率具有顯著影響，這與在其他物種中的研究結果類似（Luna et al.，2010）；As3+、As5+砷脅迫均能明顯促使銅藻體內 MDA含量上升，這與在大豆、香蒲（Typha angustifolia L.）等植物中研究結果一致（胡家恕，1995；陳天等，2020）。在As3+、As5+砷脅迫條件下，伴隨著銅藻體內 OFR產生速率及 MDA含量的上升，藻體的相對電導率也明顯提高，其中 200 mmol·L?1時 As3+、As5+實驗組的藻體相對電導率較對照組 0 mmol·L?1分別提高了 4.2、4.0倍，這表明在實驗濃度下不同價態的砷脅迫均對銅藻幼苗產生了明顯的細胞損傷。由于本研究選取的砷脅迫濃度較高，As3+、As5+實驗組的銅藻幼苗均受到嚴重細胞損傷，因此不同價態實驗組在相對電導率、OFR產生速率及MDA含量等指標總體差異不顯著，但在50、100 mmol·L?1低濃度實驗組不同價態的砷脅迫對藻體產生的脅迫效果并不一致，As3+實驗組的相對電導率、MDA含量明顯高于 As5+實驗組。不同價態砷脅迫EC50對比發現，As5+EC50值為As3+EC50值的2.3倍，綜合低濃度砷脅迫實驗組相對電導率、MDA含量差異，我們認為在 50—100 mmol·L?1濃度范圍內As3+相較于 As5+對銅藻幼苗產生的脅迫效應更強，這在動物的相關研究中也有類似發現（Basu et al.，2001）。

3.2 砷脅迫對銅藻抗氧化系統的影響

抗氧化酶與抗氧化物共同組成了生物體的抗氧化系統，并在應對外界脅迫產生的氧化損傷中發揮重要作用（Sanità di Toppi et al.，2008）。SOD 能將 OFR轉化為 H2O2，而 POD、CAT則進一步將H2O2轉化為H2O（馬思思等，2020）。本研究發現，隨著砷脅迫濃度的增加，銅藻中SOD、POD的酶活性明顯升高，但CAT酶活性則變化不明顯。這與重金屬脅迫下大葉井口邊草（Pteris cretica var.nervosa）、中國蓮（Nelumbo nucifera）及梭魚草（Pontederia cordata）等植物中的SOD、POD活性變化趨勢較為一致（樊香絨等，2013；胡擁軍等，2015；馬思思等，2020），這表明銅藻可通過 SOD與POD協同作用消除非生物脅迫下產生的活性氧。然而也有研究發現，SOD與CAT可協同減輕半葉馬尾藻（Sargassum hemiphyllum）的鎘脅迫效應（葉鵬浩等，2019），這可能是由于不同海藻種類的抗氧化酶系統對不同重金屬脅迫的響應機制存在差異而導致的結果。NPT能與游離態重金屬絡合消除或降低重金屬造成的氧化損傷（原海燕等，2013），且有研究發現 As5+脅迫能明顯提高煙草（Nicotiana tabacum）、桐花樹（Aegiceras corniculatum）幼苗中NPT含量（Wojas et al.，2010；吳桂容等，2016）。本研究發現，在銅藻中不僅As5+脅迫能促使NPT含量上升，而且As3+脅迫也具有類似效果。GSH在植物緩解砷脅迫的過程中發揮著重要的抗氧化作用（Pu et al.，2014；吳桂容等，2016），但是GSH會隨著脅迫作用的加劇而逐漸被消耗（Bankaji et al.，2015；芮海云等，2018）。我們發現銅藻幼苗為應對砷脅迫會提升藻體 GSH含量，且隨著脅迫濃度的增加藻體內GSH含量出現下降趨勢?？傊槊{迫濃度對銅藻抗氧化系統中抗氧化酶（SOD、POD）和抗氧化物（GSH、NPT）影響較為明顯。

不同價態的砷脅迫對銅藻抗氧化系統產生的影響并不完全一致。本研究選取了較高的砷脅迫濃度，由于銅藻幼苗受到較強的氧化損傷，因而總體上不同價態砷脅迫對抗氧化系統產生的差異并不顯著。但不同價態實驗組兩兩比對發現，在較低砷濃度范圍（50—100 mmol·L?1）和高濃度范圍（150—200 mmol·L?1）時，不同價態實驗組的部分抗氧化系統生理指標存在顯著差異。如50 mmol·L?1時As3+實驗組的 NPT含量明顯高于 As5+實驗組；100 mmol·L?1時 As3+實驗組的 SOD、POD 活性明顯高于 As5+實驗組；相較于 100 mmol·L?1As3+實驗組，200 mmol·L?1As3+實驗組的 GSH 含量、NPT 含量顯著降低，但As5+實驗組的GSH含量、NPT含量降低并不明顯。

3.3 銅藻抗氧化系統的主成分分析

我們對銅藻抗氧化系統中SOD、POD、CAT、GSH、NPT等抗氧化生理指標進行主成分分析，提取到兩個主成分Y1和Y2，其中Y1貢獻率達到55.3%，是Y2貢獻率的1.9倍。在Y1中，NPT、GSH、SOD、POD均具有較高的貢獻系數，這表明NPT、GSH、SOD、POD在銅藻抗氧化過程中起到了重要作用。這與隨著砷脅迫濃度的增加銅藻中的抗氧化酶（SOD、POD）酶活及抗氧化物（GSH、NPT）的含量上升的實驗結果相一致。從圖6可以看出，GSH、NPT的向量方向及長度較接近，這表明兩種抗氧化物對各砷脅迫實驗組具有相似影響，同理 SOD、POD也對各實驗組具有相似影響；但GSH、NPT與SOD、POD的向量方向卻不相同，這表明抗氧化物（GSH、NPT）與抗氧化酶（SOD、POD）對各砷脅迫實驗組的影響存在差異。對低濃度實驗組（As3+50 mmol·L?1；As5+100 mmol·L?1）而言，抗氧化物（NPT、GSH）發揮主導作用；而對高濃度實驗組（As3+100 mmol·L?1；As5+200 mmol·L?1），抗氧化酶（SOD、POD）則發揮主導作用。這與鎘脅迫下地衣（Trebouxia impressa）的生理研究結果類似（Sanità di Toppi et al.，2008），即當鎘脅迫濃度較低時，以NPT為代表的抗氧化物起主要防御作用，而當鎘脅迫濃度較高時，NPT類的抗氧化物下降，以抗氧化酶及脅迫蛋白發揮主要防御作用。

圖6 銅藻抗氧化系統PCA分析Fig.6 PCA analysis of antioxidant system in S.horneri

基于主成分對各砷脅迫濃度實驗組進行抗氧化綜合得分計算并排序。結果表明隨砷脅迫濃度升高，As3+實驗組抗氧化綜合得分持續降低，而As5+實驗組抗氧化綜合得分則先升高后下降。我們發現臨近 EC50的砷脅迫實驗組傾向具有較高的抗氧化綜合分值，由此推斷過度的細胞氧化損傷是導致抗氧化綜合分值下降的重要原因，而抗氧化綜合分數的變化一定程度上也反映了銅藻幼苗抗氧化系統對砷脅迫的響應。隨著砷濃度提高，脅迫壓力增加，藻體內抗氧化酶活性及抗氧化物含量相應上升，使得抗氧化綜合分值升高；當砷濃度過高時，藻體細胞氧化損傷加劇，部分細胞死亡，使得藻體內抗氧化酶活性及抗氧化物含量降低，導致抗氧化綜合得分降低。由于As3+EC50較低，相對較低的As3+脅迫濃度即能造成較為嚴重的氧化損傷，因此As3+實驗組抗氧化綜合得分隨砷濃度升高持續降低；As5+EC50較高，因此As5+實驗組抗氧化綜合得分隨砷濃度升高先升高，待砷濃度大于100 mmol·L?1時，細胞氧化損傷加劇，導致As5+實驗組抗氧化綜合得分出現下降趨勢。

4 結論

As3+、As5+脅迫均能誘導銅藻幼苗產生氧化損傷，但銅藻As3+EC50的值僅為As5+EC50的43.5%。隨著As3+、As5+砷脅迫濃度的上升，銅藻OFR產生速率、MDA含量及藻體相對電導率呈上升趨勢，為了減輕砷脅迫造成的氧化損傷，抗氧化酶（SOD、POD）活性和抗氧化物（GSH、NPT）含量也相應提高，但隨著氧化損傷加劇，抗氧化物（GSH、NPT）含量出現不同程度的降低。砷脅迫濃度對氧化損傷指標（OFR產生速率、MDA含量、相對電導率）、抗氧化酶（SOD、POD）活性和抗氧化物（GSH、NPT）含量均有顯著影響。主成分分析表明，在較低濃度砷脅迫下，藻體抗氧化系統傾向于抗氧化物（GSH、NPT）；而在較高濃度砷脅迫時，藻體抗氧化系統傾向于抗氧化酶（SOD、POD）。砷脅迫濃度過高，可導致藻體氧化損傷進一步加劇，部分細胞的損傷死亡則減弱了藻體抗氧化系統的響應。