墊狀卷柏提取物不同極性部位對人白血病細胞K562增殖抑制作用的研究

河南省許昌市中心醫院（461000）張應

墊狀卷柏是卷柏科卷柏屬植物，在我國有廣泛的分布和使用，具有活血通經、化癖止血的功效[1]。近年來藥理學研究表明墊狀卷柏具有多種藥理學活性，其中抗腫瘤活性具有特異性得到關注和重視[2][3]。本課題組前期對墊狀卷柏提取物(Selaginelpulvinate extracts，SP)的抗腫瘤活性進行系統性的篩選，發現SP對人白血病細胞系K562有較強的增殖抑制作用，且其增殖抑制作用是通過誘導細胞凋亡實現的，但同時也注意到SP的體外抗腫瘤活性不是很強，故筆者開展SP不同極性部位對K562腫瘤細胞活性的進一步研究。匯報如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及藥材 人慢性髓系白血病細胞系（K562）購于中國科學院基礎醫學研究院細胞庫。墊狀卷柏購于安徽亳州滕王藥業有限公司，批號為1907003，為全草干燥狀態。

1.2 試劑 RPMI-1640培養液、滅菌胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購于Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇購于國藥化試。

1.3 儀器 超聲波清洗儀（KQ-500，昆山市超聲儀器有限公司）；HERACELL 150i型CO2細胞培養箱（Thermofisher公司）；生物安全柜（美國LABCONCO公司）；CKX41型倒置光學顯微鏡（Olympus公司）；全自動酶標儀（Thermo）；Anke TDL-40型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH-60L型恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KB，安海申安醫療器械廠）。

1.4 SP不同極性部位的制備 取墊狀卷柏干燥全草，粉碎過40目篩備用。稱取10kg狀卷柏干燥全草粉末，以75%乙醇作為提取溶劑（料液比1∶20），浸提24h后，加熱回流提取1h，真空抽濾后濾渣重復上操作2次，最后合并濾液，旋蒸濃縮后并減壓干燥，共得589g（得率為5.89%）。取墊狀卷柏提取物500g用適量純化水混懸后，采用不同極性溶劑進行依次萃取，依次為：石油醚、乙酸乙酯、正丁醇。減壓濃縮干燥后分別得到SP不同極性部位粉末或浸膏，石油醚極性部位4.2g（得率為0.049%），乙酸乙酯極性部位60.2g（得率為0.709%），正丁醇極性部位110.7g（得率為3.185%）；剩余的水液減壓濃縮干燥，得到水層極性部位270.4g（得率為3.185%）。

1.5 樣品溶液的制備 實驗臨用前用DMSO溶解得到高濃度的母液，0.22μm濾膜過除濾后待用，給藥時用PBS溶液稀釋至所需的濃度。最高給藥濃度組所用的藥液中DMSO濃度均小于0.3%，預實驗表明含0.3%DMSO的PBS組與PBS空白組相比較，對本研究所涉及腫瘤細胞株的吸光度均無顯著性差異（P>0.05），說明含0.3%DMSO的PBS對本研究中所有腫瘤細胞株的增殖無影響。

1.6 SP不同極性部位對腫瘤細胞的體外抗腫瘤活性檢測取對數生長期的人慢性髓系K562腫瘤細胞，脫壁重懸后，以6×104個/mL濃度接種于96孔板中，每孔100μL，移入CO2細胞培養箱培養24h后，吸棄原培養液，加入RPMI1640培養液90μL，再加入10μL不同濃度的SP不同極性部位溶液，每個藥物濃度設置平行6個復孔，上下為本底對照，并另設PBS作為空白對照組。最后移入CO2細胞培養箱再培養，48h后吸棄培養液，加入0.5mg/mL MTT溶液10μL培養4h后棄MTT溶液，每孔加DMSO150μL，在微量振蕩儀避光振蕩10min，用酶標儀檢測490nm波長處的吸光度（A值）。細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組A值/空白對照組A值）×100%。藥物半數抑制濃度IC50用SPSS16.0軟件進行計算。

1.7 統計學方法 采用SPSS19.0軟件統計分析。組間計量數據比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SP不同極性部位對多種腫瘤細胞株增殖的影響 MTT結果顯示，與PBS空白對照組相比，在設定實驗濃度下SP水層部位對細胞增殖抑制率未發現有明顯差異(P＞0.05)，說明SP水層部位在設定的濃度下對K562腫瘤細胞株的增殖無影響；與PBS空白對照組相比，SP石油醚部位(10μg/mL～250μg/mL濃度范圍內)、SP乙酸乙酯部位(5μg/mL～250μg/mL濃度范圍內)和SP正辛醇部位(25μg/mL～250μg/mL濃度范圍內)對K562腫瘤細胞株均有明顯增殖抑制作用(P＜0.05)，且抑制效應呈明顯的濃度依賴性，如附圖所示。

附圖 不同濃度SP極性部位對各系腫瘤細胞增殖作用的影響(±s,n=6)

2.2 SP不同極性部位對多種腫瘤細胞株增殖抑制的IC50SP不同極性部位對K562腫瘤細胞株的IC50通過SPSS16.0軟件計算，SP水層部位無細胞增殖活性無法計算；SP石油醚部位、SP乙酸乙酯部位和SP正辛醇部位分別為45.7μg/mL、16.1μg/mL和159.8μg/mL，其中SP乙酸乙酯部位的IC50遠小于其他極性部位的IC50，差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

卷柏屬植物作為民間傳統草藥被用于腫瘤方面的治療，其中卷柏屬植物中的墊狀卷柏被中國藥典收錄，主治經閉痛經、損傷跌等癥，其成分較為復雜，主要有雙黃酮類、炔酚類、苯丙素類、生物堿類等[4][5]。

本課題組前期對SP在不同系列腫瘤細胞系的增殖活性進行篩選，發現對人白血病細胞系K562的敏感性最高且作為機制是誘導細胞凋亡，但IC50均較高約在200μg/mL；筆者對SP通過萃取得到不同極性部位，發現SP乙酸乙酯部位活性最高，IC50僅為SP的1/10。但SP乙酸乙酯部位其中化學成分也較為復雜，有些化合物可能并不具有抗腫瘤活性，甚至可能抑制抗腫瘤活性。這些都十分值得進一步的深入研究，這也是本課題組下一步的主要研究方向。

綜上所述，SP乙酸乙酯部位對K562腫瘤細胞有較高的增殖抑制活性，其中可能發揮抗腫瘤活性的主要成分及相應機制需進一步的研究。