ROC曲線在河源市新生兒G6PD缺乏癥篩查截斷值中的應用

劉運華 吳坤 劉曉燕

大多數葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Deficiency，G6PD）缺乏癥終生無癥狀，而感染等促發因素作用下或者在伯氨喹、拉布立酶等藥物使用下，會導致嚴重急性溶血性貧血和黃疸［1］。研究發現，新生兒黃疸患者中G6PD 缺乏癥的優勢比（Odds Ratio）為8.01［2］，及早發現和治療能夠有效避免和減少輸血治療。

按《新生兒疾病篩查技術規范（2010年版）》［3］和《新生兒疾病篩查管理辦法》［4］要求，用熒光免疫分析法測G6PD 活性進行篩查。G6PD 活性受基因調控，研究表明G6PD 缺乏癥有遺傳異質性，發現200 多種G6PD 基因突變位點［5］。G6PD 的活性和穩定性與突變位點密切相關［6］。因不同種族、地域G6PD 基因突變頻率不同及實驗環境等多方面的差異，需建立實驗室的截斷值。用ROC 曲線法建立河源地區新生兒G6PD 缺乏癥篩查截斷值，為當地出生人群G6PD 防控策略提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本

標本均在家屬同意條件下采集。檢測2015年1月至2020年12月在轄區內分娩的新生兒干血斑，共213 261 例，男性113 842 例，女 性99 419例。按《新生兒疾病篩查技術規范（2010年版）》［3］要求，納入標準：充分哺乳條件下，于分娩后3～7 天（早產兒、極低體重兒等可延遲至20 天）采血，至少3 個血斑，且每個血斑直徑大于8 毫米，血滴自然滲透，濾紙正反面血斑一致，無污染。常溫下平放晾干，應避免紫外線或陽光照射，信息完整。排除標準：血斑過小，血滴未滲透，有污染，溶血，信息不完整等。研究經醫院倫理委員會批準同意開展。

1.2 試劑與儀器

G6PD 測定試劑盒（熒光法，6199860，芬蘭雷勃診斷試劑有限公司，960T/盒）、G6PD 測定試劑盒（比值法，20152400813，科方生物技術股份有限公司，A 液：5 mL/盒，B 液：5 mL/盒）、G6PD 基因突變檢測試劑盒（20071501，廈門致善生物科技股份有限公司，48T/盒）。Fluoroskan Ascent 熒光讀數儀（Thermo，美國）、iEMS 恒溫孵育振蕩器（Thermo，美國）、ANI Labsystems Woodpecker 打孔儀（Thermo，美國）、日立7180 全自動生化分析儀（HITACHI，日本）、核酸提取儀Lab-Aid 824（致善，中國）、實時熒光PCR 儀CFX96（伯樂，美國）。

1.3 篩查方法

按說明書操作，以中、低值的質控品作為質量控制，每年參與并通過國家臨床檢驗中心室間質量評價。結果判斷：以說明書推薦的截斷值（≤3.00 U/gHb）或暫行截斷值（≤4.50 U/gHb），如G6PD活性≤3.00 或4.50 U/gHb 為篩查陽性；如G6PD 活性＞3.00 或4.50 U/gHb 為篩查陰性。按《新生兒疾病篩查管理辦法》［4］召回管理制度，非本院分娩的篩查陽性新生兒由采血單位召回驗證。

1.4 驗證方法

取枸櫞酸抗凝血2 mL，以G6PD/6PGD 比值法進行驗證。驗證結果判斷：新生兒（年齡≤28 d），比值＞1.1，判為陰性，1.05≤比值≤1.10 為可疑陽性，建議復查，比值＜1.05，判為陽性；非新生兒（年齡＞28 d），比值＞1.0，判為陰性，0.95≤比值≤1.00 為可疑陽性，建議復查，比值＜0.95，判為陽性。

1.5 G6PD 基因突變檢測

取EDTA 抗凝血2 mL，用熒光PCR 熔解曲線法測中國人群常見12 種突變點：c.517T＞C、c.392G＞T、c.487G＞A、c.592C＞T、c.95A＞G、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.383T＞C 和c.1388G＞A。

1.6 統計學分析

用SPSS 19.0 軟件進行分析；計數資料用n（%）表示，用χ2檢驗；計量資料用（）表示，組間比較用獨立樣本t檢驗；篩查截斷值用ROC 曲線，用MedCalc 軟件制作受試者工作特征曲線；P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 G6PD 缺乏癥篩查截斷值的建立

在男性和女性組中，G6PD 缺乏癥分別占21.00%（1548/7373）、25.04%（335/1338），ROC 曲線下面積分別為0.995（標準誤為0.001，95%CI：0.993～0.997，U=367.727，P＜0.001）、0.983（標 準誤 為0.0002，95%CI：0.974～0.989，U=174.302，P＜0.001），對應男、女性的截斷值均為4.42 U/gHb。見圖1。

圖1 G6PD 活性ROC 曲線Figure 1 ROC Curve for G6PD Activity

2.2 不同G6PD 截斷值的相關指標評價

對說明書推薦的截斷值（3.00 U/gHb）、暫行截斷值（4.50 U/gHb）、ROC 曲線推薦的截斷值（4.42 U/gHb）進行分析，不同截斷值在不同性別中的相關評價指標。見表1、表2。

表1 男性新生兒不同G6PD 截斷值的相關指標評價Table 1 Evaluation of relevant indicators of different G6PD cut-off values in male newborns

表2 女性新生兒不同G6PD 截斷值的相關指標評價Table 2 Evaluation of relevant indicators of different G6PD cut-off values in female newborns

2.3 部分新生兒G6PD 基因突變情況

隨機選取14 名男性與27 名女性新生兒行G6PD 基因檢測，結果：在男性組，11 名未發現突變位點，3 名半合子突變，突變位點分別為c.1376G＞T、c.95A＞G、c.871G＞A。在女性組，4 名未發現突變位點，1 名雙雜合子突變（c.1024C＞T 合 并c.1376G＞T），22 名雜合子突變：突變位點依次為9例c.1376G＞T、6 例c.1388G＞A、2 例c.95A＞G、1 例c.871G＞A、1 例c.392G＞T、1 例c.517T＞C、1 例c.519C＞T、1 例c.592C＞T。選擇女性新生兒的G6PD 突變基因與G6PD 活性和G6PD/6PGD 比值均進行相關性分析，21 例G6PD 雜合突變新生兒G6PD 活性大于3.00 U/gHb，其中8 例G6PD/6PGD比值＜1.05 為G6PD 缺乏癥者，13 例G6PD/6PGD 比值≥1.05。見圖2。

圖2 41 例新生兒G6PD 突變基因分析Figure 2 Analysis of G6PD mutation gene in 41 newborns

2.4 不同截斷值G6PD 缺乏癥篩查情況

截斷值由3.00 U/gHb 升至4.50 U/gHb，女性陽性率明顯升高，男性升高不明顯，見表3。

表3 不同截斷值G6PD 缺乏癥篩查結果［n（%）］Table 3 Screening results for G6PD deficiency at different cut-off values［n（%）］

2.5 不同截斷值G6PD 缺乏癥篩查陽性確診情況

截斷值為3.00 U/gHb 時，本院標本篩查總陽性率為6.66%（1 171/17 575），男性為10.59%（1 019/9 625），女性為1.91%（152/7950）。截斷值為4.50 U/gHb 時，本院標本篩查總陽性率為8.89%（3 669/41 251），男性為11.61%（2 587/22 285），女性為5.70%（1 082/18 966）。截斷值為3.00 U/gHb 與4.50 U/gHb 時確診情況如表4。由截斷值為3.00 U/gHb、4.50 U/gHb 時可推算河源新生兒G6PD 缺乏癥總體發生率分別為6.57%、8.84%。

表4 不同截斷值缺乏癥初篩陽性新生兒確診情況［n（%）］Table 4 Confirmation of newborns with positive primary screening for deficiency at different cut-off values［n（%）］

2.6 河源地區新生兒G6PD 活性分布情況

113 842 例男性和99 419 例女性新生兒G6PD活性均屬正偏態性分布，見圖3。男性組，1%、5%、10%分位數值分別為0.21 U/gHb、0.62 U/gHb、2.00 U/gHb，均值為8.06 U/gHb，標準差為3.49 U/gHb；女性組，1%、5%、10%分位數值分別為1.02 U/gHb、4.01 U/gHb、4.91 U/gHb，均值為8.34 U/gHb，標準差為2.88 U/gHb。截斷值由3.00 U/gHb 升至4.50 U/gHb 時，男女可分別新增917、3 791 名 可 疑G6PD 缺乏癥。

圖3 新生兒G6PD 活性分布Figure 3 Distribution of G6PD activity in newborns

3 討論

篩查截斷值選擇有三種方式，一是根據試劑盒截斷值來判讀結果［7］，二是參考G6PD 缺乏癥新生兒篩查診斷和治療專家共識［8］，三是根據當地情況，建立截斷值。盡管國內有將百分位數法作為制定篩查截斷值的研究，但其無法具體表達敏感度和特異度兩者間的關系，僅適用于建立醫學參考范圍。ROC 曲線通過動態改變G6PD 活性的截斷值，獲得對應靈敏度與特異度，較百分位數法更能展示任意截斷值時對疾病的識別能力。ROC 曲線的截斷值為4.42 U/gHb，男性和女性ROC 曲線下面積分別為0.995、0.983。一般認為ROC 曲線下面積大于0.9 時診斷準確性較好。研究發現，以說明書推薦的3.00 U/gHb 為截斷值，可大大減少召回數量，減輕家長經濟負擔，但會大幅增加假陰性，讓G6PD 缺乏癥新生兒錯過最佳治療時期，造成嚴重后果。綜合各評價指標，實驗室仍用4.50 U/gHb 作為G6PD 缺乏癥篩查截斷值。

為驗證截斷值的科學性，隨機選取14 名男性與27 名女性新生兒行G6PD 基因檢測，研究發現，不同基因突變會導致不同水平的G6PD 活性下降，與以往研究一致，女性雜合子G6PD 活性范圍波動較大［9］。部分攜帶G6PD 突變基因的女性，其G6PD 活性為3.00～4.50 U/gHb，按3.00 U/gHb 作為截斷值，將會漏診。男性組未發現G6PD 活性為3.00～4.50 U/gHb 的半合子新生兒，其原因可能是標本量少。此外發現c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G 是3 種主要基因突變類型，與全國其它地區一致［10］。

河源地區出生人群G6PD 缺乏癥陽性率高于同為粵北地區的梅州市5.18%［11］、清遠市7.94%［12］、韶關市5.19%［13］，結論同以往研究一致［14-15］。男性G6PD 缺乏癥比女性更易受累，主要臨床表現一般在半合子男性和純合子女性中被注意到［16］，而一些雜合女性因臨床表現輕而拒絕召回。

研究收集部分新生兒數據繪制ROC 曲線，建立的G6PD 篩查截斷值需在臨床實踐中不斷進行驗證，定期重新評估。研究發現，常規G6PD 酶測定法易漏診雜合子女性，了解女性G6PD 基因的雜合子狀態將有助避免雜合子女性成為氧化應激食物和藥物的受害者［17］。近年來，有研究人員設置不同G6PD 活性的截斷值，以區分正常、雜合基因突變個體［18］，豐富了常規G6PD 酶測定法的意義。

建立河源地區G6PD 篩查截斷值，有助于提高本地G6PD 缺乏癥檢出率，減少和預防G6PD 缺乏引起的系列疾病發生。