急性腦梗死患者外周血miR-497-5p表達的變化及臨床意義

王娜 劉敏 傅美麗

急性腦梗死（Acute cerebral infarction，ACI）是我國常見的心腦血管疾病之一，具有發病率高、致殘率高、復發率高的特點。顱內動脈閉塞后腦組織發生缺血缺氧損害是急性腦梗死基本的病理生理特征，在缺血缺氧過程中炎癥反應、氧化應激反應的激活會加重神經功能損害［1-2］。近些年，越來越多的學者以炎癥反應、氧化應激反應為切入點研究急性腦梗死的發病機制。微小RNA（microRNA，miR）是一組不具備轉錄功能的小分子RNA，廣泛表達于全身多個組織且發揮多樣的生物學作用。有動物實驗發現，大鼠大腦中動脈閉塞后miR-497-5p 的表達顯著增加，抑制miR-497-5p 能夠減輕大腦中動脈閉塞小鼠神經功能的損害，同時也改善炎癥反應和氧化應激反應［3］。但miR-497-5p 在急性腦梗死發病中與炎癥反應、氧化應激及的關系尚缺乏足夠的臨床證據。因此，本研究將以急性腦梗死患者為對象，探究外周血miR-497-5p 表達與炎癥因子、氧化應激產物釋放及90 d 預后的關系，旨在闡明miR-497-5p 在急性腦梗死發病中的作用及可能機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018年4月至2020年4月期間本院收治的急性腦梗死患者作為急性腦梗死組，入組標準：①符合指南中急性腦梗死的診斷標準［4］；②發病至入院時間＜6 d，未接受過溶栓或介入治療；③臨床資料及樣本完整。排除標準：①既往有腦梗死、心肌梗死、腦外傷病史；②合并惡性腫瘤、急慢性感染。另取同期體檢的健康志愿者作為對照組。急性腦梗死組共132 例，包括男性78 例、女性54 例，年齡平均（59.39±10.92）歲；對照組共106 例，包括男性67 例、女性39 例，年齡平均（57.51±11.34）歲。兩組間一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究取得醫院倫理委員會批準，取得研究對象知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血miR-497-5p 表達水平的檢測

急性腦梗死組患者入院后24 h 內取外周靜脈血1～3 mL，對照組志愿者體檢時取外周靜脈血1～3 mL，采用試劑盒（北京天根生化公司、批號DP433）提取外周血中的miR，將miR 反轉錄為相應的cDNA 后進行熒光定量PCR 反應，反應所用引物為目的基因miR-497-5p 的特異性引物及內參基因U6 的特異性引物，在熒光定量PCR 儀（美國Bio-rad 公司，型號：CFX96）上完成PCR 反應后得到反應曲線，根據曲線對應的循環閾值、以U6 為內參計算miR-497-5p 的表達水平。計算急性腦梗死組患者外周血miR-497-5p 表達水平的中位數，表達水平≥中位數為高表達、＜中位數為低表達。

1.2.2 血清炎癥因子及氧化應激產物的檢測

急性腦梗死組患者入院后24 h 內取外周靜脈血3～5 mL，對照組志愿者體檢時取外周靜脈血3～5 mL，靜置30 min 后3 000 r/min 離心10 min，分離上層血清后采用試劑盒（上海西唐公司）檢測白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、晚期蛋白氧化產物（advanced oxidation protein products，AOPP）、8-羥基脫氧鳥苷酸（8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG）的含量，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 90 d 預后的評估

急性腦梗死發病后第90 d 時，采用門診復查或電話回訪的方式進行隨訪，根據改良Rankin 量表（Modified Rankin Scale，mRS）評分評價預后，mRS評分＞2 分為預后不良、mRS 評分≤2 分為預后良好。

1.2.4 觀察指標

兩組患者外周血miR-497-5p 表達水平，血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、AOPP、8-OHdG 的含量，預后情況。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件及Prism6.0 軟件進行統計學分析；計量資料以下（）表示，兩組間比較采用t檢驗；miR-497-5p 預測預后采用ROC 曲線分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性腦梗死組與對照組外周血miR-497-5p表達水平的比較

急性腦梗死組(1.30±0.42)患者外周血中miR-497-5p 的表達水平高于與對照組(1.00±0.26)，差異有統計學意義（t=6.430，P＜0.05）。

2.2 急性腦梗死組中miR-497-5p 低表達與高表達患者血清炎癥因子的比較

急性腦梗死組中miR-497-5p 高表達患者的血清IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量與miR-497-5p 低表達患者比較升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 急性腦梗死組中miR-497-5p 低表達與高表達患者血清炎癥因子的比較（±s）Table 1 Comparison of serum inflammatory factors between patients with low and high expression of miR-497-5p in acute cerebral infarction group（±s）

表1 急性腦梗死組中miR-497-5p 低表達與高表達患者血清炎癥因子的比較（±s）Table 1 Comparison of serum inflammatory factors between patients with low and high expression of miR-497-5p in acute cerebral infarction group（±s）

miR-497-5p 表達高表達低表達t 值P 值n 66 66 IL-1β(ng/mL)2.15±0.62 1.77±0.45 4.030 0.000 IL-6(pg/mL)5.87±1.04 4.95±0.83 5.617 0.000 TNF-α(ng/mL)22.93±7.68 19.47±5.23 3.025 0.003

2.3 急性腦梗死組中miR-497-5p 低表達與高表達患者血清氧化應激產物的比較

急性腦梗死組中miR-497-5p 高表達患者的血清MDA、AOPP、8-OHdG 的含量與miR-497-5p 低表達患者比較明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 急性腦梗死組中miR-497-5p 低表達與高表達患者血清氧化應激產物的比較（±s）Table 2 Comparison of serum oxidative stress products between patients with low and high expression of miR-497-5p in acute cerebral infarction group（±s）

表2 急性腦梗死組中miR-497-5p 低表達與高表達患者血清氧化應激產物的比較（±s）Table 2 Comparison of serum oxidative stress products between patients with low and high expression of miR-497-5p in acute cerebral infarction group（±s）

miR-497-5p表達高表達低表達t 值P 值n 66 66 MDA(μmol/L)12.58±3.62 10.77±3.11 3.081 0.003 AOPP(μmol/L)69.39±13.27 62.37±10.25 3.401 0.001 8-OHdG(ng/mL)0.84±0.20 0.73±0.16 3.490 0.001

2.4 急性腦梗死組中90 d 預后良好與預后不良患者miR-497-5p 表達水平的比較

急性腦梗死組中90 d 預后良好患者外周血中miR-497-5p 的表達水平與預后不良患者比較明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 急性腦梗死組中90 d 預后良好與預后不良患者miR-497-5p 表達水平的比較（±s）Table 3 Comparison of miR-497-5p expression levels between patients with good and poor 90 day prognosis in acute cerebral infarction group（±s）

表3 急性腦梗死組中90 d 預后良好與預后不良患者miR-497-5p 表達水平的比較（±s）Table 3 Comparison of miR-497-5p expression levels between patients with good and poor 90 day prognosis in acute cerebral infarction group（±s）

90 d 預后預后良好預后不良t 值P 值n 75 57 miR-497-5p 1.06±0.26 1.61±0.40 9.551 0.000

2.5 miR-497-5p 預測急性腦梗死患者90 d 預后的ROC 曲線分析

外周血miR-497-5p 表達水平預測急性腦梗死患者90 d 預后的ROC 曲線見圖1，AUC 為0.893，95%CI為：0.834～0.951。根據約登指數最大值確定外周血miR-497-5p 表達水平預測急性腦梗死患者90 d 預后的最佳截斷值為1.136，該截斷值預測預后的靈敏度為86.67%、特異性為80.70%。見圖1。

圖1 miR-497-5p預測急性腦梗死患者90 d預后的ROC曲線Figure 1 ROC curve of miR-497-5p in predicting 90 day prognosis of patients with acute cerebral infarction

3 討論

急性腦梗死的發病涉及復雜的病理生理機制，顱內動脈血栓栓塞或血栓形成后腦組織發生缺血缺氧損害是基本的病理生理特征，在缺血缺氧基礎上發生的炎癥反應和氧化應激反應是造成神經功能繼發性損害的重要因素，神經功能持續發生損害導致疾病的治療難度增加、致殘率升高［5-7］。因此，研究在急性腦梗死發病過程中炎癥反應及氧化應激的關鍵調控分子不僅有助于發現疾病新的治療靶點，也有助于發現病情早期評估及預測的標志物。

本研究以miR-497-5p 為切入點進行了急性腦梗死炎癥反應、氧化應激反應及預后的評估。MiR-497-5p 是近些年受到越來越多關注的一種miR。Chen X［3］的動物實驗證實，大腦中動脈閉塞大鼠的缺血腦組織中miR-497-5p 的表達水平增加，抑制miR-497-5p 的表達具有神經保護作用；閆海清［8］的細胞實驗證實，缺氧復氧的神經元中miR-497-5p 的表達水平增加，抑制miR-497-5p 的表達明顯改善缺氧復氧誘導的神經元凋亡。以上動物及細胞實驗提示缺血缺氧能夠刺激miR-497-5p表達增加，高表達的miR-497-5p 又介導了神經損害。在此基礎上，本研究分析發現急性腦梗死患者外周血中miR-497-5p 的表達水平高于對照組，表明急性腦梗死發病過程中存在miR-497-5p 的異常高表達，與既往動物實驗和細胞實驗中關于miR-497-5p表達變化的報道一致。

MiR 雖然具備編碼功能，但能通過調控下游靶基因表達的方式發揮相應的生物學效應。在急性腦梗死的發病過程中，多種miR 靶向調控炎癥反應和氧化應激反應［9-10］。根據閆海清的細胞，miR-497-5p 在缺氧復氧的神經元中靶向抑制AKT3 的表達，進而使炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及氧自由基釋放增多，氧自由基可引起脂質、蛋白質、核酸發生過氧化并生成MDA、AOPP、8-OHdG［8］。已有研究報道，急性腦梗死患者血清中炎癥因子及氧化應激產物的含量明顯增加［11-14］。本研究分析了miR-497-5p 表達與炎癥因子及氧化應激產物的關系，隨著急性腦梗死患者外周血miR-497-5p表達水平的增加，血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、AOPP、8-OHdG 的含量也呈升高趨勢，表明急性腦梗死發病過程中miR-497-5p 的異常高表達對炎癥反應及氧化應激反應具有促進作用。

炎癥反應和氧化應激反應在急性腦梗死發生后的病情轉歸中起重要作用，多項研究證實炎癥及氧化應激指標對急性腦梗死的預后具有評估價值［15-18］。本研究已經證實急性腦梗死患者miR-497-5p與炎癥反應、氧化應激反應的關系，進一步隨訪患者90d 預后并分析其與miR-497-5p 的關系可知：預后良好患者的外周血miR-497-5p 表達水平低于預后不良患者且miR-497-5p 對90d 預后具有預測價值，表明急性腦梗死發病后miR-497-5p 的異常高表達與預后不良有關。

綜上所述，急性腦梗死患者外周血miR-497-5p的異常高表達與炎癥因子、氧化應激產物釋放增多及90 d 預后不良有關，未來miR-497-5p 有望成為研究急性腦梗死發病機制及治療靶點的目標分子，也可作為急性腦梗死病情及預后評估的標志物。