PTEN、uPA和EZH2表達對胃癌術后復發預測

胡楠 湯佳琦 張競舟 周康杰 吳學雨 洪義東 吳風雷

胃癌是一種起源于胃壁表層黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，其發病率位居惡性腫瘤第2 位，死亡率較高［1］。國內外文獻均有報道，可通過CA125、CEA 等血清腫瘤標志物檢測部分胃癌患者術后是否發生復發、轉移，但這些標志物對胃癌術后復發監測特異性不高，診斷率不理想［2］。近年來，有學者報道抑癌基因磷脂酶和張力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）表達會促進腫瘤的發生發展［3］。已有相關研究報道，胃癌組織中尿激酶型纖溶酶原激活物（Urokinase-type plasminogen activator，uPA）陽性表達率較高［4］，但其與胃癌術后復發的關系研究較少。本研究旨在探討PTEN、uPA、EZH2在胃癌患者中的表達情況，并分析聯合三者檢測對胃癌術后復發的預測價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2019年1月本院接受胃癌根治術治療的80 例胃癌患者（80 份胃癌組織標本）作為胃癌組。其中男59 例，女21 例；平均年齡（63.44±5.78）歲；腫瘤位于胃底賁門者33 例，胃體者27 例，胃竇者20 例。選取上述患者遠離腫瘤3 cm 的癌旁正常組織作為癌旁組織組。

納入標準：①所有患者均經影像學檢查及術后病理檢查確診為胃癌［5］；②符合胃癌根治術的手術指征；③未合并凝血功能障礙；④未合并嚴重的心、肺等重要器官功能障礙；⑤臨床資料完整；⑥所有患者均已簽署知情同意書，研究通過醫院醫學倫理委員會批準。排除標準：①合并其他系統惡性腫瘤；②合并腸道息肉、感染性腸道疾病；③治療依從性不佳；④隨訪資料不全者。

1.2 方法

1.2.1 PTEN、uPA、EZH2檢測方法

采用免疫組化染色法檢測PTEN、uPA、EZH2表達情況。每例組織蠟塊均切片4 張，厚度約4 μm。PTEN、uPA、EZH2標本均經甲醛溶液固定，石蠟包埋、載玻片泡酸、高溫滅菌及多聚賴氨酸涂片等處理。DAB 顯色劑顯色，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。PTEN、uPA、EZH2兔多克隆抗體均采購自美國Epitomics 公司。DAB 顯色劑及配套試劑盒采購自北京中杉金橋生物技術有限公司。L.3 回旋式切片機由北京手術器械廠提供。

1.2.2 判定標準

3 位病理科醫師在光學顯微鏡下隨機觀察5個視野，要求每個視野至少計數100 個完整的腫瘤細胞。PTEN、uPA、EZH2免疫組化陽性判定標準［6］：腫瘤細胞胞質或細胞核中出現棕黃色或棕褐色顆粒，反之則為陰性。陽性細胞比例評分：0、1、2、3、4 分；染色強度評分：未染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。染色指數=陽性細胞比例評分＋染色強度評分。染色指數＞3 分為陽性；染色指數≤3 分為陰性。陽性率=陽性例數/總例數×100%。

1.3 隨訪

對80 例胃癌患者進行為期2年的隨訪，了解患者胃癌復發情況。隨訪開始時間為患者進行胃癌根治術后，隨訪截止時間為2021年1月。隨訪平均隨訪時間（15.11±2.87）個月。隨訪方式：來院復查及電話隨訪。胃癌復發標準［7］：術后2 個月，復查腹部CT，提示腔內腫塊/潰瘍，可見環提征，胃腔狹窄等影像征象，腹部增強CT 提示胃壁異常強化。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；通過Logistic 回歸模型分析影響胃癌復發的非條件單因素和多因素；繪制ROC 曲線，計算曲線下面積（AUC），以分析不同PTEN、uPA、EZH2表達鑒別診斷胃癌復發的相對應靈敏度、特異度，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中PTEN、uPA、EZH2 水平比較

胃癌組PTEN 陰性表達率顯著高于癌旁組織組，uPA 及EZH2陽性表達率顯著高于癌旁組織組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 不同組織中PTEN、uPA、EZH2 水平比較［n（%）］Table 1 Comparison of PTEN，uPA and EZH2 levels in different tissues［n（%）］

圖1 胃癌組織中PTEN、uPA、EZH2 免疫組化染色圖（SP，× 500）Figure 1 immunohistochemical staining of PTEN，uPA and EZH2 in gastric cancer（SP，× 500）

2.2 胃癌組織中不同PTEN、uPA、EZH2 表達的患者術后復發情況

80 例胃癌患者隨訪期間內有17 例患者死亡，死亡率為21.25%。80 例患者中復發率為26.25（21/80）。PTEN 陰性、uPA 陽性及EZH2陽性的患者術后復發率明顯高于PTEN 陽性、uPA 陰性及EZH2陰性的患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 胃癌組織中不同PTEN、uPA、EZH2 表達的患者術后復發情況［n（%）］Table 2 recurrence of gastric cancer patients with different expression of PTEN，uPA and EZH2［n（%）］

2.3 胃癌患者術后復發的影響因素分析

浸潤深度T4、有盆結節、PTEN 陰性、uPA 陽性、EZH2陽性為影響胃癌患者術后復發的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 胃癌患者術后復發的影響因素分析Table 3 Analysis of influencing factors of postoperative recurrence in patients with gastric cancer

2.4 PTEN、uPA、EZH2 及三者聯合檢測對胃癌患者術后復發的預測價值

PTEN、uPA、EZH2及三者聯合檢測AUC 分別為0.552、0.675、0.672、0.899，各指標AUC 以聯合檢測最大，三者聯合檢測靈敏度、特異度顯著高于PTEN、uPA、EZH2單一檢測（P＜0.05）。見表4及圖2。

圖2 PTEN、uPA、EZH2 及三者聯合檢測對胃癌患者術后復發的預測價值Figure 2 predictive value of PTEN，uPA，EZH2 and their combined detection for postoperative recurrence of gastric cancer

表4 PTEN、uPA、EZH2 及三者聯合檢測對胃癌患者術后復發的預測價值Table 4 predictive value of PTEN，uPA，EZH2 and their combined detection for postoperative recurrence of gastric cancer

3 討論

胃癌發病機制尚不明確，但有學者研究發現該病的發生與地域環境、患者飲食習慣、幽門螺桿菌感染、癌前病變及遺傳因素密切相關［8］。早期胃癌患者可通過根治手術治療切除病灶，據相關研究統計，有50%～80%的患者術后仍面臨復發、轉移的風險［9］。可見，對于胃癌患者根治術后加強監測高靈敏度、高特異度的腫瘤標志物，對評估患者預后意義重大。

PTEN基因是近年來發現的一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，具有負性調控PI3K/AKT 通路，抑制絲裂原活化的蛋白激酶通路的作用［10］。已有較多文獻報道，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌等多種惡性腫瘤中均存在PTEN基因缺失，因此認為PTEN基因與惡性腫瘤發生、發展密切相關［11］。本研究中胃癌組織中PTEN 陽性表達率明顯低于癌旁正常組織中的陽性表達率，PTEN陰性表達的胃癌患者術后復發風險明顯高于PTEN 陽性表達的患者，進一步證實上述觀點。

uPA 是一種高度特異性的絲氨酸蛋白酶，可將纖溶酶原激活呈纖溶酶，纖溶酶可降解纖維蛋白、層粘連蛋白，促進腫瘤侵襲、轉移［12］。已有相關研究報道，uPA 與血管內皮因子之間有著顯著相關性，且uPA 可為血管生成提供有利條件，影響細胞生長、分化及凋亡［13］。Haghighi 等學者［14］通過動物實驗發現，uPA 抗體具有較強的阻斷癌細胞侵襲的能力，證實uPA 在惡性腫瘤侵襲、轉移中的作用。本研究中，uPA 陽性表達的胃癌患者術后復發率為80.65%，與Lee 等學者［15］報道結果大致相同。

EZH2與細胞生長調節相關，通過抑制染色質中的靶基因而調節細胞增殖。作為轉錄阻遏因子，EZH2控制細胞的記憶系統，能夠促進細胞增殖、腫瘤細胞擴散，在多種腫瘤組織中高表達，已成為近年來研究焦點。本研究結果與國外學者報道結果相一致［16］。分析胃癌組織中EZH2陽性表達率較高的原因：可能為EZH2參與細胞周期的調控，導致胃粘膜上皮細胞周期異常，癌細胞增殖速度加快，導致胃癌患者術后復發。本研究通過繪制ROC 曲線提示聯合三者檢測比單一檢測更具預后判斷價值。

綜上，胃癌的發展、侵襲、轉移及術后復發是一個由多種基因、蛋白參與的過程，需在胃癌根治術患者術后加強PTEN、uPA、EZH2三者聯合檢測，有利于臨床綜合判斷患者術后預后情況，對指導臨床治療具有重要意義。