老年高血壓患者認知功能障礙與ApoA5 IVS3+476G＞A基因多態性關系

施勇 謝月萍 張春麗

高血壓疾病是老年人常見慢性疾病之一，嚴重影響著老年人的生活與工作，有效預防老年人高血壓疾病成為了醫學界的主要研究的課題之一［1］。高血壓疾病患者易出現認知功能障礙癥狀，尤其是老年高血壓患者［2］。隨著我國分子生物學技術以及生物信息學的不斷發展，研究高血壓疾病的遺傳因素成為了當前醫學界的熱點之一。隨著人們對高血壓患者的認知功能障礙的關注度越來越高，更多的學者研究高血壓認知功能障礙與遺傳因素的關系［3］。載脂蛋白A5（Apolipoprotein A5，ApoA5）是載脂蛋白家族成員之一，是血漿重要的組成部分，且對血漿甘油三酯水平有著巨大的影響。載脂蛋白A5 有兩個等位基因（T，C），共有三種基因型（TT、TC、CC）［4］。ApoA5基因在國內外已有研究，主要集中在與血脂代謝、動脈粥樣硬化及冠心病方面，其基因研究位點主要是-1131T＞C、C56G，亦有少量文獻報道ApoA5基因變異與腦梗死關系［5］，載脂蛋白A5 對中樞神經系統有著不利的影響，是導致患者發生認知功能障礙的主要因素［6］。而IVS3+476G＞A 位點與認知功能障礙的關系尚未見有文獻報道。因此本文探究老年高血壓患者認知功能障礙與ApoA5IVS3+476G＞A 基因多態性的關系。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月至2018年7月于本院診治的90 例老年高血壓患者。且分為老年高血壓認知功能障礙組（n=40）和認知正常組（n=50）。正常組患者男性患者為25 例，女性患者為25 例，最小年齡為65 歲，最大的年齡為82 歲，平均年齡為（73.58±5.71）歲，文化程度初中及以下16 例，高中14 例，大學及以上20 例，平均舒張壓為（83.58±10.71）mmHg，平均收縮壓為（143.89±18.74）mmHg；老年高血壓認知功能障礙組患者男性患者為20 例，女性患者為20 例，最小年齡為66 歲，最大的年齡為83 歲，平均年齡為（74.85±5.14）歲。初中及以下16例，高中9 例，大學及以上15 例，平均舒張壓為（84.78±10.25）mmHg，平均收縮壓為（142.14±17.65）mmHg；兩組患者一般資料及學歷比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。納入標準：①在未服用抗高血壓藥物的情況下，收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mmHg；②患者依從性良好且所選患者臨床資料完整。排除標準：①既往有高血壓史，目前正在服用抗高血壓藥物，血壓雖然＜140/90 mmHg，亦診斷為高血壓，臨床資料不完整者；②繼發性高血壓、嚴重心臟病和腦血管意外者、糖尿病、甲狀腺功能異常等內分疾病、抑郁、嚴重視聽功能障及失語者，中神經系統感染性疾病、腦外傷、顱內腳以及神經外科手術史者；③惡性腫瘤、肝腎功能不全、其他嚴重軀體疾病和精神疾病等患者。本研究所選患者均知情同意并簽署知情同意書，研究經倫理委員會同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料的收集

采用調查問卷的形式收集患者的一般資料，即年齡、性別、身高、體重以及學歷等因素，且詢問患者的吸煙和飲酒史。

1.2.2 血壓測量

按照WHO 標準［7］，采用汞柱式標準袖帶血壓計對患者的血壓情況進行測量，需測量3 次，時間間隔控制在2 min，取3 次測量值的平均值作為患者的血壓值。

1.2.3 認知功能的測定和分組

本文的認知功能障礙和認知功能正常分組標準如下：利用國際通用智力狀況量表（Mini Mental state examination，MMSE）［8］測定患者的認知功能。0～30 分是量表的評分范圍，其中≤24 分者為認知功能障礙組，＞24 分者為認知功能正常者。

1.2.4 載脂蛋白A5 基因多態性檢測

本文的載脂蛋白A5 基因多態性檢測為：利用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）技術測定患者的ApoA5基因。

1.2.4.1 標本采集及檢測 所有研究對象均為入院后第二天清晨空腹坐位抽取肘靜脈血兩管各3 mL，一管不抗凝，待血液凝固后，以3 000 rpm 離心10 min，分離血清。ApoA5采用免疫透射比濁法，試劑盒由英國RAnDOX 公司提供。全部測定工作在南寧市第一人民醫院檢驗科完成，使用日立7170 全自動生化分析儀進行檢測。另一管用EDTA 抗凝，低滲法裂解紅細胞，離心獲得白細胞，采用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA（ABI 公司，美國）。

1.2.4.2 引物設計與PCR 依據APO A5 基因的等位點的核苷酸堿基序列設計引物，正義鏈：5′-CTC AAG GCT GTC TTC AG-3′。反義鏈：5′-CCT TTG ATT CTG GGG ACTG G-3′（上海生工生物工程有限公司合成）。PCR 反應體系：總反應體系10 μL 中含有模板基因組1.0 μL，2.5×buffer（含Mg2+）4.0 μL，4×dnTP 4.7 μL，taq 酶0.1 μL，引物各0.2 μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃30 s，64℃30 s，72℃30 s 共35 個 循環；72℃延伸10 min。取PCR 產物約10 μL 用2%瓊脂糖凝膠電泳后，結果為一條約為280 bp 大小的目標條帶。

1.2.4.3 基因型分析 取PCR 產物約5 μL 進行酶切，內切酶Fau I（由NEB 公司提供）。酶切總反應15 μL 反應體系中含：10×NEB 緩沖液1.5 μL，PCR產物5 μL，內切酶0.8 μL。反應條件：55℃溫育3 h，4%瓊脂糖凝膠電泳。根據本所研究片段酶切位點，酶切結果：141 bp、114 bp、25 bp 大小的三條帶為純合子TT 型；141 bp、73 bp、41 bp、25 bp 大小的四條帶為雜合子TC 型；141 bp、73 bp、41 bp、25 bp大小的兩條帶為純合子CC 型。為進一步證實PCR 結果，將PCR 產物及酶切產物進行基因測序（廣州達安基因股份有限公司完成）。

1.3 統計學分析

采用SPSS 25.0 進行數據分析；計量資料采用（）表示，采用t檢驗；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；比較影響因素采用單因素及Logistic 多因素回歸分析并篩選差異明顯的危險因素；以統計學P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的ApoA5 IVS3+476G＞A 位點多態性基因型頻率比較

認知障礙組ApoA5IVS3+476G＞A 位點多態性基因型頻率與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），認知障礙組TC 的頻率和CC 的頻率明顯高于認知正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者的ApoA5 IVS3+476G＞A 位點多態性基因型頻率比較［n（%）］Table 1 Comparison of ApoA5 IVS3+476G＞A site polymorphism genotype frequency between 2 groups of patients［n（%）］

2.2 兩組患者的ApoA5 IVS3+476G＞A 位點等位基因頻率比較

認知障礙組ApoA5IVS3+476G＞A 等位基因頻率與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），認知障礙組明顯高于認知正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者的ApoA5 IVS3+476G＞A 位點等位基因頻率比較［n（%）］Table 2 Comparison of ApoA5 IVS3+476G＞A locus allele frequency between 2 groups of patients［n（%）］

2.3 高血壓患者認知功能障礙因素分析

認知障礙組ApoA5IVS3+476G＞A 基因的TT、TC、CC 與認知功能障礙呈現出正向相關性（P＜0.05），文化程度是影響認知功能障礙的保護因素（P＜0.05）。見表3。

表3 高血壓患者認知功能障礙影響因素Table 3 Analysis of influencing factors of cognitive dysfunction in patients with hypertension

3 討論

高血壓疾病具有諸多特點，如①血壓變異性較大，患者極易發生低血壓癥狀；②患者的收縮壓增加，促使患者的脈壓也在增加；③患者在患有高血壓疾病時，其患有的并發癥以及合并癥也多，包含糖尿病、高血脂、高尿酸血癥等。相關的研究表明，30%～50%的高血壓患者的致病因素為遺傳因素。即該種疾病是環境因素與遺傳因素相互作用的一種多基因遺傳性疾病，其可以分為兩種遺傳形式，即顯著遺傳和多基因關聯遺傳［9］。

ApoA5基因位于人類染色體11q23，長約2.5 Kb，與載脂蛋白A1/C3/A4 基因簇緊密相連，組成一個基因家族。apoAV 由肝臟特異性表達，分泌于血漿后存在于高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白及乳糜顆粒中，生理情況下血液中apoAV 濃度極低，僅有114～258 μg/L。多項研究表明，ApoA5基因多態性與TG 升高、冠心病、腦梗死及代謝性疾病有一定的關聯性且存在種族及地域差異［10-12］。如今，高血壓患者的認知功能障礙與載脂蛋白A5基因多態性的關系成為了熱門話題，且國內外的研究較少［13］。本文認為載脂蛋白A5 基因對于高血壓患者認知功能障礙有著較大的影響，它是導致患者發生認知功能障礙的危險因素［14］。且隨著患者年齡的增加，患者的認知功能越來越低，如果患者具有較高的學歷，其可以有效的預防高血壓患者發生認知功能障礙癥狀［15］。

多項研究表明，ApoA5基因位于人類的染色體11q23，長約2.5 kb，與載脂蛋白A1/C3/A4 基因簇緊密相連，組成一個基因家族。ApoA5由肝臟特異性表達，分泌于血漿后存在于高密度脂蛋白（HDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）及乳糜顆粒中，生理情況下血液中ApoA5 濃度極低，僅有（114～258）μg/L.ApoA 主要影響血漿TG 代謝并呈負相關。敲除純合子基因的小鼠的VLDL 水平升高，相反，轉染ApoA5基因的小鼠VLDL 水平下降：而敲除雜合子基因的小鼠的VLDL 水平介于純合子基因敲除小鼠和野生型小鼠之間，以上這些結果均表明ApoA5基因對TG 有負性調節作用。ApoA5基因多態性與TG 升高、冠心病、腦梗死及代謝性疾病有一定的關聯性且存在種族及地域差異，研究發現，ApoA5IVS3+476G＞A 基因型是所有缺血性卒中的危險因素，其機制主要是通過提高TG 水平，加速動脈粥樣硬化進程，從而增加高血壓的發生風險。目前國內尚無研究報道ApoA5IVS3+476G＞A 位點與腦梗死的關系，中國漢族人群的高血壓患者是否與ApoA5IVS3+476G＞A 位點變異有關尚未明確。與國外關于白種人的ApoA5IVS3+476G＞A 位點突變作為腦梗死危險因素的研究結果相似。

由于本實驗例數較少，尚不能準確的反映APOA5基因IVS3+476G＞A 位點是否在我國漢族人群中存在突變，更無法進一步研究此位點突變是否與認知功能障礙的發生有關，有待進一步擴大樣本研究。綜上所述，本文的實驗分析說明ApoA5IVS3+476G＞A 基因多態性可能影響患者的認知功能，對深入研究高血壓患者認知功能障礙具有著重要意義。同時對預防高血壓患者發生認知功能障礙具有指導意義。綜上所述，本文的實驗分析說明ApoA5IVS3+476G＞A 基因多態性可能影響患者的認知功能，對深入研究高血壓患者認知功能障礙具有著重要意義。同時對預防高血壓患者發生認知功能障礙具有指導意義。