鲅魚加工副產物水解液中ACE 抑制肽分離純化研究

章禹航，翟 雨，韓穎，張唯嘉，馮 濤，黃光榮

（中國計量大學生命科學學院，浙江杭州 310018）

血管緊張素轉化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE） 抑制肽，可以阻止血管緊張素II 的生成，從而起到降低血壓的作用，是近年來研究比較多的一種生物活性肽，最早于1970 年由Ferreira S H等人[1]從毒蛇毒液中分離得到。如今，已有大量報道從動植物組織中獲得并鑒定的ACE 抑制肽，且有部分已商業化應用。從動植物組織中獲得ACE 抑制肽通常有2 種手段：直接分離純化天然ACE 肽，或者是以組織蛋白質為原料進行酶解獲得ACE 肽。海洋魚類種類眾多，是制備ACE 抑制肽的良好來源之一[2-4]。鲅魚，學名“藍點馬鮫”（Scomberomorus niphonius），作為一種低價值的海洋魚類，以鮮食和初級加工為主，精深加工利用的報道相對較少。目前，在鲅魚加工副產物制備生物活性肽方面，主要有抗氧化肽[5-7]、抗菌肽[8]、礦物質結合肽[9]等。以鲅魚加工副產物為原料，先經脫脂后得到魚粉蛋白，再經堿性蛋白酶酶解，最后經超濾、層析分離和高效液相色分離得到純度較高的具有較強ACE 抑制活性的小肽，為下一步氨基酸序列鑒定提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲅魚加工副產物，浙江舟山某企業提供，實驗室冷凍保存；堿性蛋白酶，酶活力為200 U/mg；DEAE-Sepharodse FF、Sephacryl S-100 等，美國GE公司提供；HHL，生化純；乙腈、甲醇、三氟乙酸等為色譜純，乙酸乙酯、無水硫酸銅、福林酚、石油醚、乙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

Allegra X-30 型高速冷凍離心機，美國Beckman公司產品；DGG-9140B 型鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司產品；RV-10 型數顯型旋轉蒸發儀，德國IKA 公司產品；SHZ-A 型水浴恒溫振蕩器，常州人和儀器廠產品；UV1000 型分光光度計，上海元析儀器有限公司產品；ATKA Pure 20 型蛋白純化系統，美國GE 公司產品；LC-6AD 型半制備高效液相色譜，日本島津公司產品；Masterflex L/S 型超濾系統，美國Cole-Pharmer 公司產品；8010S 型組織搗碎機，美國Waring 公司產品；Scientz-30 型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 鲅魚酶解液的制備

鲅魚加工副產物用流水解凍后，剔除骨頭和雜質，經組織搗碎機打成漿，以1∶5（W∶V） 比例的異丙醇于75 ℃下脫脂回流3h，然后過濾，得到的濾渣在55 ℃下鼓風干燥1~2 h，再經粉碎，過100 目篩，于玻璃瓶中密封，備用。

稱取30 g 脫脂魚粉，分散到濃度為20 mmol/L，pH 值8.67 的Tris-HCl 緩沖液2 L 中，攪拌混勻，并在55 ℃下恒溫10 min 后加入75 mg 堿性蛋白酶，攪拌混勻，開始計時，水解4.45 h。然后于沸水浴中加熱10 min，使酶失活，再經流水冷卻到室溫后進行離心（以轉速12 000 r/min 離心20 min），收集上清液，4 ℃下保存，備用。

1.3.2 超濾分離

水解液先經0.45 μm 微孔濾膜過濾，再依次通過10，5，3 kDa 的膜包進行超濾，收集到4 個組分：組分 I（>10 kDa）、組分 II（5~10 kDa）、組分III（3~5 kDa）、組分IV（<3 kDa）。組分經冷凍干燥后，密封保存，備用。

1.3.3 離子交換層析分離

將超濾組分以蒸餾水溶解（20 mg/mL），在ATKA Pure 20 型蛋白純化系統中進行DEAESepaherose FF 陰離子交換層析（1.0 cm×40 cm）。梯度洗脫緩沖液為：A 液，50 mmol/L，pH 值7.0 Tris-HCl 溶液；B 液，1.0 mol/L NaCl 溶液的 A 液；洗脫流速為1.0 mL/min，進樣體積為5.0 mL。洗脫程序：①A 液洗脫30 min；②120 min 內B 液升到100%；③B 液洗脫60 min；④A 液洗脫60 min。重復以上操作，收集A220nm組分，冷凍干燥保存。

1.3.4 凝膠過濾層析

將離子交換層析組分以蒸餾水溶解（20 mg/mL），在ATKA Pure 20 蛋白純化系統中進行Sephacryl S-100 HR 凝膠過濾層析（1.6 cm×60 cm），以蒸餾水為流動相進行等度洗脫，流速1.0 mL/min，進樣量0.5 mL。重復以上操作，收集A220nm組分，冷凍干燥保存。

1.3.5 反相高效液相色譜

將凝膠過濾層析組分以蒸餾水溶解（1.0 mg/mL），在LC-6AD 型半制備高效液相色譜中進行分離，色譜條件：進樣量10 μL，色譜柱為C18柱（Waters Sunfire，4.6 cm×250 mm，5.0 μm），檢測波長220 nm，流速為0.6 mL/min，梯度洗脫（60 min 內流動相乙腈由5%線性增加到40%）。重復以上操作，收集A220nm組分，并經旋轉蒸發濃縮后進行蛋白質和活性測定。

1.4 測定方法

1.4.1 水解度測定

采用茚三酮比色法測定游離氨基含量[10]，總蛋白質采用凱氏定氮法測定[11]，用已水解的氨基數占原料總氨基百分數表示水解度。

1.4.2 蛋白質含量測定

可溶性蛋白質含量測定采用福林酚法[12]。

1.4.3 ACE 抑制率測定

樣品根據測定的蛋白質濃度以蒸餾水稀釋到0.5 mg/mL 后，采用液相色譜法測定[13]，高效液相色譜樣品稀釋到0.1 mg/mL 后測定。

1.5 數據處理

數據3 次平行測定，以平均值±SD 表示。

2 結果與分析

2.1 超濾

鲅魚脫脂粉以堿性蛋白酶水解，得到酶解液，測得其水解度為32.84%。將酶解液超濾分離，獲得4 個超濾組分：組分 I（>10 kDa）、組分 II（5~10 kDa）、組分 III（3~5 kDa） 和組分 IV （<3 kDa）。

超濾各組分的ACE 抑制率見圖1。

圖1 超濾各組分的ACE 抑制率

由圖1 可知，組分Ⅳ（分子量小于3 kDa） 的ACE 抑制活性最高，抑制率達45.6%，這與朱國萍等人[14]對蝦頭自溶釋放出的肽類產物進行超濾分離出的結果相類似，有文獻報道很多ACE 抑制肽由15 個以下氨基酸組成[15]。因此，選擇組分Ⅳ進一步分離純化。

2.2 離子交換層析

將超濾得到的分子量小于3 kDa 組分IV，進一步經DEAE-Seopharose FF 陰離子交換層析分離。

DEAE-Sepharose FF 陰離子交換層析分離圖見圖2，離子交換層析分離各組分ACE 抑制活性見表1。

圖2 DEAE-Sepharose FF 陰離子交換層析分離圖

表1 離子交換層析分離各組分ACE 抑制活性/%

由圖2 可知，經DEAE-Seopharose FF 分離可得到3 個組分，大量重復收集組分，測定ACE 抑制率。結果表明，組分A2 的ACE 抑制率最高，達50.3%，組分A3 則最低，僅12.4%。將A2 組分進行凍干，作為凝膠過濾層析用樣品。

2.3 凝膠過濾層析

Sephacryl S-100 HR 凝膠過濾層析分離圖見圖3，凝膠過濾層析分離各組分ACE 抑制活性見表2。

圖3 Sephacryl S-100 HR 凝膠過濾層析分離圖

表2 凝膠過濾層析分離各組分ACE 抑制活性/%

將組分A2 溶解于蒸餾水后，置于凝膠過濾柱層析分離，并收集組分，測定ACE 抑制率。由圖3 可知，經Sephacryl S-100 HR 層析分離后得到2 個主要峰組分B1 和B2，測定其ACE 抑制活性。由表2可知，B1 和B2 組分的ACE 抑制率分別為31.1%和83.4%，顯然，分子量更小的B2 組分的ACE 抑制活性高于B1 組分。收集B2 組分，冷凍干燥后供反相高效液相色譜分離。

2.4 反相高效液相色譜

將凝膠過濾層析收集的具有最高ACE 抑制活性的組分B2，進一步進行半制備液相色譜分離純化。結果表明，在5 min 與7 min 處有2 個峰，分別標記為組分C1 和C2，經ACE 抑制活性測定，發現C2組分ACE 抑制率接近于0，C1 組分ACE 抑制率為87.6%（蛋白質質量濃度0.1 mg/mL）。

反相高效液相色譜分離圖見圖4。

圖4 反相高效液相色譜分離圖

3 結論

以鲅魚加工副產物為原料，經堿性蛋白酶水解，以期獲得ACE 抑制肽。酶解液經超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析和反相高效液相色譜等分離純化步驟，獲得具有較高純度的ACE 抑制活性組分，ACE 抑制率達87.6%（0.1 mg/mL）。研究結果為鲅魚加工副產物高附加值利用和預防高血壓的功能性食品開發提供了參考，后續將進一步對C1 組分進行氨基酸序列鑒定，并人工合成該小肽，進行活性驗證，同時試驗其在模型細胞中的ACE 抑制活性及試驗動物中的活性，還將進一步研究其在消化道中穩定性與吸收特性等，以期為鲅魚加工副產物制備降血壓肽的商業化應用提供基礎數據。