苦參堿聯用順鉑對HepG2肝癌細胞荷瘤裸鼠的增效減毒作用研究

黎明吉 周喜漢 楊煥珍 黃思玲

【摘要】 目的 探討苦參堿聯用順鉑對HepG2肝癌細胞荷瘤裸鼠的增效減毒作用。

方法 將HepG2肝癌細胞在裸鼠腋部皮下注射接種，構建出裸鼠皮下移植瘤實驗動物模型。將25只瘤徑≥5 mm雌性裸鼠（視為造模成功）完全隨機劃分成5組（每組5只）：正常對照組、順鉑組（DDP組，2 mg/kg）、低劑量苦參堿（25 mg/kg）+順鉑（2 mg/kg）組、中劑量苦參堿（50 mg/kg）+順鉑（2 mg/kg）組、高劑量苦參堿（100 mg/kg）+順鉑（2 mg/kg）組。裸鼠成瘤后藥物干預14 d，取出瘤體，用千分電子秤稱量瘤重，用公式計算抑瘤率。公式計算腎指數、肝指數、脾指數，檢測肝、腎功能。

結果 增效方面，各用藥組與正常對照組相比瘤重量降低（P<0.05），各劑量苦參堿聯用順鉑組與DDP組相比，瘤重量較小（P<0.05）。DDP組及低、中、高劑量苦參堿聯用順鉑組抑瘤率依次為58.3%、76.7%、79.6%、82.1%。減毒方面，與DDP組相比，低劑量苦參堿+DDP組、高劑量苦參堿+DDP組血清膽堿酯酶增加（P<0.05）。DDP組較正常對照組BUN升高（P<0.05），低劑量苦參堿+DDP組BUN較DDP組增加（P<0.05），而中、高劑量苦參堿聯用順鉑組BUN有回落趨勢。低、中、高劑量苦參堿聯用順鉑組的腎指數較單用順鉑組高（P<0.05）。

結論 苦參堿與順鉑聯用可提高抑瘤率，高劑量苦參堿對順鉑引起的肝損害、腎損害具有一定的緩解作用。

【關鍵詞】 苦參堿;不同劑量;順鉑;減毒;增效

中圖分類號：R735.7 ? 文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.05.003

【Abstract】 Objective To investigate the synergism and attenuation effects of matrine （Ma） combined with cisplatin on tumor-bearing nude mice with HepG2 hepatoma cells.

Methods HepG2 hepatoma cells were injected subcutaneously into the axillary region of nude mice to establish an experimental animal model of subcutaneous transplanted tumor in nude mice. A total of 25 female nude mice with tumor diameter ≥ 5mm （regarded as successful modeling） were randomly divided into the ?following 5 groups （5 mice in each group）： normal control group， cisplatin group （DDP group， 2 mg/kg）， low dose matrine （25 mg/kg） + cisplatin （2 mg/kg） group， medium dose matrine （50 mg/kg） + cisplatin group （2 mg/kg） group， and high dose ?matrine （100 mg/kg） + cisplatin （2 mg/kg） group. After 14 days of drug intervention， the tumor bodies were taken out， the tumor weight was weighed by thousandth electronic scale， and the tumor inhibition rate was calculated by formula. In addition， kidney index， liver index and spleen index were calculated by the formula to detect liver and kidney functions.

Results In terms of synergism effect， the tumor mass of each drug group was significantly lower than that of the model group （P < 0.05）， and the tumor mass of each dose of matrine combined with cisplatin group was smaller than that of the DDP group （P < 0.05）. The tumor inhibition rates of the DDP group and the low， medium and high dose matrine combined with cisplatin groups were 58.3%， 76.7%， 79.6% and 82.1%， respectively. In terms of attenuation effect， compared with the DDP group， serum cholinesterase increased in the low dose matrine + DDP group and the high dose matrine + DDP group （P < 0.05）. Compared with the normal control group， the BUN of the DDP group increased （P < 0.05）， and the BUN of the low dose matrine + DDP group increased （P < 0.05）， while the BUN of the medium dose matrine + DDP group and the high dose matrine + DDP group showed a downward trend. The renal indexes of the low， medium and high matrine + DDP groups were higher than that of the DDP group （P < 0.05）.

Conclusion Matrine combined with cisplatin can improve tumor inhibition rate， and high dose of matrine can alleviate liver and kidney damage caused by cisplatin to some extent.

【Key words】 matrine; different doses; cisplatin; synergism; attenuation

原發性肝癌（簡稱為肝癌）是全球癌癥相關死亡的第三大主要原因，大部分患者在診斷時已屬于肝癌晚期，預后差[1]。目前我國肝癌成為第4位（消化系統惡性腫瘤第2位）常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，年齡調整發病率呈逐年下降趨勢，但肝癌發病人數仍占全球的55%，肝癌所導致的疾病負擔仍呈上升趨勢，患者5年生存率無顯著提高[2]。肝癌的發生可以將其歸因于明確的風險因素（主要是慢性病毒性肝炎和酒精/非酒精性脂肪性肝炎）所導致的肝硬化[3]。目前肝癌的主要治療手段仍以外科手術切除為主，輔以放化療和靶向治療等，近幾年肝癌術后的聯合化療成為肝癌治療的研究熱點，其中中藥在聯合經典化療藥物（如鉑類）治療中的應用特別是其減毒增效作用是肝癌綜合治療的研究焦點，對改善患者生活質量，降低經典化療藥物的毒副作用具有不可小覷的意義。苦參堿（Matrine，Ma）是傳統中藥苦參的主要藥效成分之一，大量研究發現其具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝和強心等作用。苦參堿可誘導惡性腫瘤細胞的凋亡，增強化療藥物的抗癌能力[4]。本研究選用肝癌細胞HepG2造模的4周齡雌性裸鼠進行試驗，觀察苦參堿對順鉑的增效減毒作用，為進一步深入研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院，由右江民族醫學院科學實驗中心保存于液氮中。

1.1.2 實驗動物

選用30只BALB/c-nu裸鼠（SPF級，雌性），4周齡，重量13～14 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于右江民族醫學院SPF級動物房內，裸鼠飲用水、飼料、墊料均經高溫高壓滅菌處理，所用物資來源于本校動物實驗室。

1.1.3 主要藥品與試劑

苦參堿：上海阿拉丁生化科技股份有限公司（批號：A1812039）;注射用順鉑（批號：國藥準字H20023460）;Gemini南美胎牛血清，Solarbio 1×PBS（pH=7.3±0.1），Gibco DMEM高糖培養基、Solarbio胰蛋白酶消化液。丙氨酸氨基轉移酶試劑盒（ALT，批號：45606501）、天門冬氨酸氨基轉移酶試劑盒（AST，批號：45883101）、膽堿酯酶檢測試劑盒（CHE2，批號：47270601）、尿素/尿素氮檢測試劑盒（BUN，批號：49766601）、肌酐檢測試劑盒（Cr，批號：49963101）均購自羅氏（Roche）診斷產品（上海）有限公司。

1.1.4 主要儀器

KDC-2046低速冷凍離心機（ZONKIA，安徽中科中佳科學儀器有限公司），全自動生化儀（cobas 8000，Roche），ME203電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將本校提供的HepG2肝癌細胞株培養于含有10%胎牛血清的Gibco DMEM高糖培養基細胞培養液，放置在37℃、5%二氧化碳濃度及飽和濕度的恒溫培養箱（型號MCO-18AIC）中培養;12～24 h后HepG2細胞貼壁生長于培養瓶底部培養基中，收集對數生長期（活力最佳）細胞用于實驗。

1.2.2 裸鼠腫瘤模型建立

購買30只BALB/c-nu裸鼠（雌性，SPF級），嚴格飼養在恒濕（50%～55%）、恒溫（20℃～27℃）、空氣清潔層流、無特定病原體（specific pathogen free，SPF）的動物架上;飼養盒、空氣過濾罩、動物飲用水、飼料等均經高溫高壓蒸氣滅菌，2～3 d適時更換。于無菌檢疫室飼養1周后，轉移至SPF級小鼠房，碘伏消毒裸鼠腋下皮膚及周圍，將對數生長期HepG2細胞注射至已消毒腋部皮下，細胞數量為1×107個（0.2 mL）。繼續飼養已接種裸鼠，觀察其腋部接種部位有無破潰、滲液，觀察其精神狀態、活躍性、飲食、排便。接種7～10 d后，可在其接種腋下皮膚觸及米粒大小、質硬的結節，則為HepG2肝癌細胞荷瘤裸鼠造模成功。

1.2.3 實驗分組及處理

從30只已造模雌性裸鼠中完全隨機選取25只（瘤徑≥5 mm），其余5只備用，將25只雌性裸鼠完全隨機分成5組（每組5只）：正常對照組、順鉑組（DDP組，2 mg/kg）、低劑量苦參堿（25 mg/kg）+順鉑（2 mg/kg）組、中劑量苦參堿（50 mg/kg）+順鉑（2 mg/kg）組、高劑量苦參堿（100 mg/kg）+順鉑（2 mg/kg）組。分別腹腔注射：生理鹽水、順鉑（2 mg/kg）、苦參堿（25 mg/kg）+順鉑（2 mg/kg）、苦參堿（50 mg/kg）+順鉑（2 mg/kg）、苦參堿（100 mg/kg）+順鉑（2 mg/kg），注射液體體積均為0.2 mL，隔天注射，共注射14 d。

1.2.4 觀察和測量

觀察荷瘤裸鼠腋部腫物變化及其精神狀態、活躍性、飲食、排便。每次用藥前測量裸鼠體重，用藥14天后（隔天給藥，共8次）眼球采集實驗裸鼠血液標本，離心獲得血清后檢測肝腎功能，ALT、AST、BUN、Cr采用吸光度測量法測定，膽堿酯酶采用比色法測定;以上指標均采用全自動生化儀cobas 8000 檢測，嚴格按試劑盒說明進行測定。取出瘤體，用千分電子秤稱量瘤重，用公式計算抑瘤率;采集裸鼠脾臟稱重，計算脾指數=（脾重量/每10 g裸鼠重）;采集裸鼠雙腎稱重，計算腎指數=（腎重量/每10 g裸鼠重）;采集裸鼠肝臟稱重，計算肝指數=（肝重量/每10 g裸鼠重）。

1.3 統計學方法

用SPSS 22.0統計軟件進行分析，以（±s）表示計量資料，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多組間均數的兩兩比較采用q檢驗。α=0.05為檢驗水準，雙側檢驗。

2 結 ?果

2.1 增效方面

各用藥組與正常對照組相比瘤重量降低，差異有統計學意義（P<0.05），各劑量苦參堿聯用順鉑組與DDP組相比，瘤重量更小，差異有統計學意義（P<0.05）。DDP組及低、中、高劑量苦參堿聯用順鉑組抑瘤率依次為58.3%、76.7%、79.6%、82.1%。各用藥組脾指數均下降，差異有統計學意義（P<0.001）。見表1。

2.2 減毒方面

2.2.1 對ALT、AST、膽堿酯酶及肝指數的影響

與DDP組相比，低劑量苦參堿+順鉑組、高劑量苦參堿+順鉑組血清膽堿酯酶增加，差異有統計學意義（P<0.05）。各用藥組ALT、AST、肝指數比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.2.2 對BUN、Cr及腎指數的影響

DDP組較正常對照組BUN升高（P<0.05）。低劑量苦參堿+順鉑組BUN較DDP組增加（P<0.05）。中劑量苦參堿+順鉑組、高劑量苦參堿+順鉑組BUN較低劑量苦參堿+順鉑組減少（P<0.05），高劑量苦參堿+DDP組BUN較中劑量苦參堿+DDP組減少（P<0.05）。各劑量苦參堿聯用順鉑組的腎指數均高于DDP組（P<0.05）。見表3。

3 討 ?論

原發性肝癌的治療領域是多學科、多種方法共同組成的。目前肝癌的治療方法主要為肝腫瘤切除、肝臟移植、局部消融、TACE、放療、藥物治療等[5]。盡管新興的治療手段如免疫治療、溶瘤病毒等逐漸成為研究熱點，但迄今為止，化學療法仍是克服和根除癌癥的理想選擇[6]。順鉑是一種含鉑金屬基的抗癌藥，其作用部位主要位于細胞DNA的嘧啶和嘌呤堿基，于1978年首次被批準用作抗腫瘤藥，在當今許多形式的癌癥中仍然是一種重要而有效的化療藥物[7]。臨床上順鉑仍是針對各種類型的實體瘤如卵巢癌、睪丸癌、膀胱癌、肺癌、宮頸癌、食道癌、頭頸癌的一線治療[8]。雖然順鉑在多種實體瘤的治療應用廣泛，抗瘤效果顯著，但其副作用和耐藥性仍是不可忽視的兩個固有挑戰，這限制了順鉑的應用和有效性。為了使順鉑的副作用和耐藥性減至最小，目前提倡使用聯合療法，并且已證明聯合療法對缺陷癌癥更有效[9]。

苦參堿是一種利用現代工業技術從傳統中藥苦參中分離提純的生物堿。大量研究證明苦參堿具有抗癌作用，可以抑制癌細胞的增殖，阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡，并抑制癌細胞的轉移，同時還具有逆轉抗癌藥的耐藥性并降低抗癌藥毒性的作用[10]。本實驗中，筆者以HepG2肝癌荷瘤裸鼠為模型，分別以單用順鉑、不同劑量苦參堿聯合相同劑量順鉑，以瘤重、抑瘤率、脾指數作為增效觀察指標，以裸鼠肝功能（ALT、AST、血清膽堿酯酶、肝指數）、腎功能（BUN、Cr、腎指數）、脾指數作為減毒觀察指標進行實驗。在增效方面，各用藥組與正常對照組相比，瘤重均減少，低劑量苦參堿聯用順鉑時抑瘤率比單用順鉑組增高，腫瘤抑制率隨苦參堿濃度增高而上升，可知低劑量苦參堿即可明顯提高單用順鉑化療的抑瘤率，且苦參堿劑量越大，抑瘤率越高。脾臟是人體最大的外周淋巴器官，其富含各種淋巴細胞（B淋巴細胞約55%），同時擁有全身循環T淋巴細胞的25%，因此具有廣泛的免疫功能，并在造血和紅細胞清除中發揮作用[11]，可反映出機體免疫力的強弱。本實驗發現，各用藥組脾指數均下降，低、中、高劑量苦參堿對順鉑引起的脾臟縮小無明顯改善，考慮可能與苦參堿對順鉑化療引起免疫抑制的副作用改善效果不佳有關。血清膽堿酯酶是肝細胞合成的酶類之一，且由于其半衰期短，促使它成為一種極為敏感的肝損指標，可用于反映肝臟的合成功能，直接協助對當前肝臟的儲備功能的評估，長期觀測還可用于肝病預后的評估。在減毒方面，各用藥組ALT、AST、肝指數無明顯差異;低、中、高劑量苦參堿聯用順鉑組血清膽堿酯酶較單用順鉑組高，而高劑量苦參堿聯用順鉑組的血清膽堿酯酶升高更為明顯，從而可看出苦參堿能促進肝細胞的合成功能。順鉑的副作用常見為腎臟損害、消化道反應、免疫抑制、骨髓抑制、神經系統損害等，其中對腎臟的損害是限制其劑量的主要因素之一[7]。在減毒方面，各用藥組肌酐無明顯差異;單用順鉑組較正常對照組BUN升高，低劑量苦參堿聯用順鉑組BUN較單用順鉑組增加，提示低劑量苦參堿可能加重順鉑對腎臟的損害，中、高劑量苦參堿聯用順鉑組BUN有回落趨勢，且隨著苦參堿劑量增加，BUN回落更明顯，可看出高劑量苦參堿可保護腎臟免受順鉑損害。腎指數可反映腎臟損害的嚴重程度，各劑量苦參堿聯用順鉑組的腎指數均高于單用順鉑組，從而可看出苦參堿能減少順鉑對腎臟的損害。

綜上所述，苦參堿與順鉑聯用可抑制瘤體生長，提高抑瘤率，促進肝臟合成功能，增強機體對抗化療藥物的肝臟損害，高劑量時可減輕順鉑對腎臟損害。本研究為Ma在腫瘤化療中增效減毒的作用提供了科學依據。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-02-05 修回日期：2020-04-13）

（編輯：潘明志）