HPLC法同時(shí)測(cè)定清火抗毒丸中三種成分的含量

郭慧青 趙穎 高振東 張旭東 顧艷麗 徐佳璐 謝宇鑫

【摘 要】 目的：創(chuàng)建HPLC 法同時(shí)測(cè)定清火抗毒丸中龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的含量。方法：色譜柱選擇ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速選擇1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，波長(zhǎng)選擇254 nm。結(jié)果：龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷分別在8.6～86 μg·mL-1（r=0.9999）、4.4～44 μg·mL-1（r=1）、5.5～55 μg·mL-1 （r=0.9998）范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的平均加樣回收率依次為101.24%（RSD=1.06%），98.64%（ RSD=1.04%），99.38%（ RSD=0.45%）。結(jié)論：該方法不僅簡(jiǎn)單易行而且重復(fù)性好，其構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)有助于清火抗毒丸的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 清火抗毒丸;龍膽苦苷;梔子苷;黃芩苷;含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.2 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2021）11-0033-04

Abstract：Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of gentiopicroside， geniposide and baicalin in Qinghuo Kangdu Pills. Methods The analytical column was ODS-C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， methanol-0.1% H3PO4 was mobile phase;gradient; the flow rate was 1 mL·min-1， the column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was 254 nm. Results The linear range was 8.6-86 μg·mL-1（r=0.9999） for gentiopicroside， 4.4～44 μg·mL-1（r=1）for geniposide and 5.5～55 μg·mL-1（r=0.9998） for baicalin. The average recovery of gentiopicroside， geniposide and baicalin was 101.24%（RSD=1.06%），98.64%（ RSD=1.04%） and 99.38%（ RSD=0.45%） . Conclusion The method is simple， and repeatable， which can be used to determine the contents of three key constituents in Qinghuo Kangdu Pill at the same time， and it is a good method to control the quality of Qinghuo Kangdu Pill.

Keywords：Qinghuo Kangdu Pill; Gentiopicroside; Geniposide; Scutellaria Baicalensis; Content Determinat

清火抗毒丸是巴彥淖爾市眼科醫(yī)院中醫(yī)醫(yī)師常用且效果良好的內(nèi)服組方，由梔子、龍膽、黃芩、黃連和黃柏等十三味藥組成，具有抗菌、抗炎、解毒、清熱等功效，適用于角膜炎、細(xì)菌性或病毒性結(jié)膜炎、瞼板腺感染及化膿性淚腺炎等眼瞼及眼眶炎癥疾病的治療。方中龍膽能夠殺毒抑菌、瀉肝膽實(shí)火，可以治療肝火過盛引起的目赤目腫目痛。其主要成分為龍膽苦苷，龍膽苦苷主要通過抑制多種炎癥介質(zhì)的釋放起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用[1]。梔子能用于清熱瀉火、涼血消腫解毒，可廣泛應(yīng)用于治療因血熱導(dǎo)致的急性鼻出血、眼腫痛。梔子苷是梔子的主要成分，梔子苷抗炎、鎮(zhèn)靜、降壓、解熱作用突出[2]。黃芩主要有效成分為黃芩苷，黃芩苷有明顯抗菌作用[3]，機(jī)制有二：一是能有效的抑制細(xì)菌新的生物膜合成，致其繁殖減慢;二是使細(xì)菌生物膜的滲透性增加利于抗菌藥物進(jìn)入。黃芩苷、龍膽苦苷和梔子苷三種成分共同具有抗炎解毒作用，為本方治療眼部炎癥及感染的主要有效成分，含量測(cè)定選擇同時(shí)測(cè)定這三種成分，不僅操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，最重要的是能為本藥藥效是否良好提供標(biāo)準(zhǔn)，保證藥品質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)使用的高效液相色譜法具備操作自動(dòng)簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏、分離效率高和分離速度快等優(yōu)點(diǎn)，在生藥、復(fù)方中藥等復(fù)雜體系的成分分離分析中發(fā)揮重要作用。復(fù)方中藥中多指標(biāo)的同時(shí)測(cè)定能直接反映藥品的質(zhì)量的同時(shí)還能夠減少分析的成本，提升分析的準(zhǔn)確度。該制劑目前已完成前期成型工藝，為提高藥品的質(zhì)量控制要求，本實(shí)驗(yàn)從主要成分的含量測(cè)定方面進(jìn)行研究，擬制定清火抗毒丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），高效液相色譜儀Dionex Ultimate 3000（賽默飛世爾科技有限公司），AR224CZ萬分之一電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.2 材料 黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110726-201706）;龍膽苦苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110770-201716）;梔子苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110749-201718）。清火抗毒丸（巴彥淖爾市殘聯(lián)眼科醫(yī)院提供，批號(hào)20190103、20190105、20190107），經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中藥學(xué)渠弼教授鑒定。甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液;柱溫：30℃;流速：1 mL·min-1;波長(zhǎng)：254 nm。以下專屬性、線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收實(shí)驗(yàn)均使用此色譜條件。梯度洗脫程序見表1。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、龍膽苦苷和梔子苷對(duì)照品適量溶于色譜甲醇，定容即得混標(biāo)溶液，其每1 mL對(duì)照品溶液中包括黃芩苷、龍膽苦苷、梔子苷分別為55 μg、44 μg和86 μg。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱定0.2 g清火抗毒丸粉末于錐形瓶中，加甲醇25 mL，精密稱定錐形瓶，密塞，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，重新稱定其重量，甲醇補(bǔ)足缺失重量，搖勻并濾過，取續(xù)濾液，續(xù)濾液用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液[4]。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 將本方各個(gè)藥材粉碎過篩，全方分別除去龍膽，梔子和黃芩按各自處方比混合，根據(jù)“2.3”項(xiàng)方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn) 取“2.2”、“2.3”、“2.4”項(xiàng)下溶液各10μL進(jìn)樣，相同保留時(shí)間下，供試品溶液在龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷相應(yīng)位置有色譜峰，陰性對(duì)照溶液相同位置未見干擾，表明該方法具有專屬性良好，結(jié)果如圖2所示。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下溶液0.5、1、2、4、5 mL置5 mL容量瓶中，甲醇定容并搖勻，測(cè)定線性關(guān)系。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（ X，mg·mL-1） 為橫坐標(biāo)，作圖，分別得出龍膽苦苷的線性方程：Y=143.02X+0.0742（r=0.9999），梔子苷線性方程：Y=157.72X-0.0081（r=1），黃芩苷線性方程：Y=235.99X+0.4012 （r=0.9998）。龍膽苦苷在8.6～86 μg·mL-1、梔子苷在4.4～44 μg·mL-1、黃芩苷在 5.5～55 μg·mL-1與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下溶液，進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積。龍膽苦苷、梔子苷以及黃芩苷對(duì)照品的峰面積RSD依次為0.16%、0.08%和0.13%（n=6），結(jié)果顯示該儀器精密度良好[5]。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同批次樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣，記錄各峰面積，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷峰面積的RSD依次為0.66%，1.97%，0.47%（n=6）。表明樣品溶液放置24 h各成分含量穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 選同批次樣品（批號(hào)：20190103），按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，測(cè)定各峰面積，結(jié)果顯示龍膽苦苷、梔子苷以及黃芩苷峰面積的RSD 分別為1.0%、1.4%、1.5%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗(yàn) 取同批樣品6份（批號(hào)：20190103），精密稱定，每份約0.1 g，分別加入龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對(duì)照品溶液1 mL（濃度依次為6.5、8、24.5 μg·mL-1），測(cè)定峰面積，各成分平均加樣回收率分別為101.24%、98.64%、99.38%，RSD分別為1.06%、1.04%、0.45%（n=6）。

2.11 樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批次的樣品（批號(hào)：20190103、20190105、20190107），按照“2.3”項(xiàng)方法，制備供試品溶液平行樣3份，測(cè)定每批樣品中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 選擇測(cè)定波長(zhǎng) 紫外-可見分光光度儀測(cè)定結(jié)果顯示：龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)分別是270 nm、242 nm、276 nm。改變波長(zhǎng)進(jìn)樣后，發(fā)現(xiàn)254 nm處同時(shí)測(cè)定含量時(shí)，各峰的分離度較好，基線較平，峰面積較大，所以選擇在254 nm下對(duì)三種成分進(jìn)行含量測(cè)定[6-8]。

3.2 流動(dòng)相的選擇 用甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液作為兩種待選流動(dòng)相，當(dāng)選用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，出峰時(shí)間較早，而且龍膽苦苷峰和梔子苷峰不能實(shí)現(xiàn)良好分離，并且基線不平穩(wěn);當(dāng)采用甲醇-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，此條件下各峰分離很好，而且均符合藥典的要求，因此選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相。

3.3 提取溶劑和方法 首先對(duì)50%甲醇、70%甲醇和甲醇三種提取溶劑進(jìn)行考察，使用甲醇作提取溶劑時(shí)，提取出的供試品溶液中三種成分的綜合提取率最佳;采用不同時(shí)長(zhǎng)超聲（15、30、60 min）處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)超聲處理30 min和60 min的供試品溶液中三種成分的提取率無明顯差異，其中超聲15 min時(shí)的提取率較低，因此選擇超聲30 min提取，操作簡(jiǎn)便且能量消耗少。

本實(shí)驗(yàn)通過綜合考量測(cè)定波長(zhǎng)、色譜條件、提取工藝等可能影響含量檢定的各類因素，篩選出適合同時(shí)測(cè)定三種成分的HPLC法，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，此法可作為清火抗毒丸的質(zhì)量控制指標(biāo)。

4 小結(jié)與展望

隨著現(xiàn)代檢測(cè)分析方法如高效液相色譜的不斷發(fā)展，復(fù)方中藥的研究也逐漸深入，分離、測(cè)定中藥有效成分，闡明中藥作用機(jī)理等工作正有序開展，并取得了可觀成果。復(fù)方中藥發(fā)揮藥效時(shí)通常是多種有效成分共同協(xié)作，可能是一味藥增強(qiáng)另一味藥的治療作用，或者是一味藥消除其他味藥的副作用，單獨(dú)測(cè)定一種主要有效成分通常不能很好控制復(fù)方藥的質(zhì)量。因此在復(fù)方中藥的質(zhì)量控制中多指標(biāo)成分的分離與測(cè)定具有特別重要的意義。在同一方劑中，復(fù)方中藥的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)特征以及復(fù)方藥效受藥材中指標(biāo)成分影響，而配伍藥材的比例與其各自含量又顯著影響指標(biāo)成分的高低[9]。因此復(fù)方中藥配伍以后，各指標(biāo)成分的比例、含量不僅僅能夠反映藥物制劑的工藝水平，更重要的是能夠表征和確保復(fù)方中藥（及其制劑）的藥物療效。清火抗毒丸是民間應(yīng)用廣泛的復(fù)方中藥，其治療如上所述眼科疾病療效確切，但因其處方復(fù)雜，有效成分尚待分離確定，導(dǎo)致本藥生產(chǎn)過程中的質(zhì)控環(huán)節(jié)難以規(guī)范。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定清火抗毒丸龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的含量， 通過方法學(xué)驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)所建立的方法不僅簡(jiǎn)單，而且可靠，此法用于清火抗毒丸的質(zhì)量控制將給制備和檢測(cè)工作帶來極大便利。清火抗毒丸仍有許多輔助發(fā)揮藥效的有效成分未被分離發(fā)掘，建立適當(dāng)分析方法來測(cè)定其他重要組分，并詳細(xì)研究其作用靶點(diǎn)、機(jī)制通路都將是后續(xù)研究的方向。

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（收稿日期：2020-11-03 編輯：程鵬飛）