酶法米糠制取油脂及蛋白多肽工藝技術的研究*

于坤弘，陳 星，代雅杰，江連洲，于殿宇，潘明喆**，姚 凱

（1.黑龍江北大荒豐威食品有限公司，哈爾濱 150010；2.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；3.湖北天星糧油股份有限公司，湖北 隨州 431500）

在稻米加工的過程中，近60%的營養物質殘留在米糠中不被利用[1]。其中，蛋白質含量為15%左右，是制備抗氧化、抗肥胖、抗血管增生、抗高血壓等活性肽的良好來源；脂肪含量約為18%～23%，且多不飽和脂肪酸與單不飽和脂肪酸含量較高；無氮浸出物包括淀粉、纖維素和半纖維素等占33%～56%，部分半纖維素構成水溶性米糠多糖，糖類物質中寡糖鏈易與多肽鏈中的某些氨基酸殘基以糖苷鍵共價相連形成糖蛋白。此外，米糠還富含維生素E、谷維素、甾醇等生物活性物質，因此被美國食品和藥品管理局認定為它可以作為食品原料或配料，應用于全谷物食品、米糠主食、全谷物早餐等食品行業,米糠營養物質的提取和利用也成為一大研究熱點。

但米糠脂肪酶的活性較強，在生產過程中易造成油脂腐敗和蛋白質變性。目前國內外主要通過化學法、酶法[2]和物理法等高新技術鈍化米糠中的脂肪酶，達到穩定米糠的作用，以此提高米糠的利用率。王蕾等[3]在纖維素酶酶解脫脂米糠的基礎上，以堿溶酸沉法為輔助提取米糠蛋白，米糠蛋白的提取率最高為48.97%，純度為74.43%。但化學法提取蛋白容易發生化學殘留，且在反應過程中蛋白質易變性。超聲空化效應在不破壞米糠細胞結構的基礎上直接提取蛋白質，有利于獲得純度較高的蛋白質，與木瓜蛋白酶結合米糠蛋白的溶解度可達74.83%[4]，但由于超聲設備昂貴，只適用于實驗室研究。

擠壓膨化作為一種物理方法[5-6]，主要是通過擠壓機螺桿產生的推動力，使物料受到混合、攪拌和高剪切力作用，從而發生膨化。研究表明，擠壓膨化對米糠中脂肪酶的活性有著明顯的抑制作用，有利于米糠理化性質的穩定。因此，本研究選用通過擠壓膨化鈍化的新鮮全脂米糠為原料，探究了酶添加量、pH、酶解時間、酶解溫度、液料比等因素對鈍化新鮮全脂米糠提油率的影響，并考察了通過添加糖化酶酶解提油后的酶解底物，減少成品中的水溶性糖類物質，以提高米糠蛋白多肽產品的質量。

1 材料與方法

1.1 材料

鈍化新鮮全脂米糠，湖北天星糧油股份有限公司；對硝基苯酚基月桂酸酯（p-NPL），山東西亞化學工業有限公司；Triton X-100，廣州共慶化工有限公司；阿拉伯膠，上海聯碩生物科技有限公司；纖維素酶：酶活力為700 EGU/g，諾維信公司提供，最適溫度為50～60℃，最適pH為4.5～6.0；堿性蛋白酶200 000 U/g、糖化酶150 000 U/g，南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KTJ16型可調控的酶膜反應器Φ 1.6×2.0 m，酶膜使用5次，離心分離機，蒸發濃縮罐，蒸發能力200 kg/h，噴霧干燥塔SUS 304水分蒸發5 kg/h。

1.3 鈍化全脂新鮮米糠

利用雙螺桿擠壓膨化機擠壓，機筒溫度130℃、螺桿轉速160 r/min、模頭孔徑8 mm，對新鮮全脂米糠進行穩定化處理，得到鈍化全脂新鮮米糠。

1.4 鈍化全脂新鮮米糠的酶法提油

按照一定液料比添加水，用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液調節料液pH 4.0～8.0。料液溫度為35～55℃時，添加一定量的酶，酶解2～6 h，酶解過程中保持混合液pH不變并不斷攪拌，使物料充分被酶解。分離游離油和乳狀液，將乳狀液加熱到95℃破乳分離，合并油項[7]。

1.5 米糠酶解物的糖化酶解

水酶法提油后的余下物質稱為米糠酶解物，通過調整pH，加入一定量的糖酶，在一定溫度、時間條件下，糖化米糠酶解物中的糖類物質，調整pH后離心分離，經濃縮噴霧干燥，得到米糠蛋白多肽。

1.6 脂肪酶活性測定

參考Laokuldilok[8]的方法。以p-NPL為底物，將適量酶液加入相應底物溶液中，混合物在35℃的振蕩水浴中孵育20 min。通過煮沸5 min終止反應。離心后（臺式離心機，6 000 r/min，10 min），在410 nm處測量澄清上清液的吸光度。一個單位（U）的酶活性被定義為在測定條件下每分鐘釋放1 000 PnP所需的酶量。

1.7 總糖測定

采用蒽酮-硫酸法[9]測定米糠中的總糖含量。用分析天平稱量0.200 0蒽酮，加80%硫酸溶液溶解后置于容量瓶中定容。將樣品溶液和葡萄糖標準品溶液于具塞試管中，加入蒽酮-硫酸溶液反應，以去離子水為空白對照，在500～900 nm范圍內測定其吸光度值。

1.8 蛋白質分子質量測定

采用分子篩層析法確定米糠多肽的相對分子質量。將米糠蛋白肽溶液進行稀釋，搖勻待用；制備標準多糖溶液和藍色聚多糖溶液。用Sephade?xG-200填柱，待凝膠柱平衡后加入樣品。當藍色物質流出時，開始收集洗脫液。洗脫液進行稀釋后，在490 nm下測吸光度代表標準葡聚糖的吸光度；在280 nm下吸光度值代表蛋白質的吸光度，可根據標準葡聚糖和米糠蛋白多肽的出峰位置計算蛋白質分子量。

1.9 水解度測定（DH）

采用 pH-stat法[10]。

式中，B為NaOH所用體積（mL）；N為NaOH濃度（mol/L）；MP為原料中蛋白質質量（g）；α為氨基酸平均解離常數；htot為每克原料蛋白質中含有肽鍵毫摩爾數。

1.10 蛋白質回收率計算

蛋白質回收量測定采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)。

式中，m為上清液中蛋白質回收量（g）；M為蛋白質總量（g）。

1.11 蛋白酶酶活

采用Folin-酚法，采用分光光度計進行測定。取1 mL樣品溶液（約含20～250 μg多肽或蛋白質），加入5 mL氫氧化銅溶液，混勻，于20～25℃放置10 min，再加入0.5 mL試劑乙（Folin氏試劑），立即振蕩搖勻，在20～25℃保溫30 min，然后于500 nm處比色。以1 mL水代替樣品作為空白對照。

1.12 提油率

本試驗將提油率定義為采用水酶法提取的游離油質量之和與米糠質量的百分比（%，g/g）。

1.13 油脂品質測定

酸值AV：參照GB/T 5530-2005測定；過氧化值PV：參照GB/T 5538-2005測定；

皂化值SV：參照GB T 5534-2008測定；碘值IV：參照GB/T 13892-2012；折光指數RI：參照GB/T 5527-2010。

1.14 蛋白質分散指數測定

蛋白質分散指數是一項衡量食物蛋白質功能性質的指標，為蛋白質中能在水中分散的蛋白質量占該蛋白質總量的百分比（%）。

1.15 谷維素測定

標準曲線繪制：稱量0.020 8 g γ-谷維素，加入適量三氯乙烷進行溶解，用正己烷定容容量瓶中。標準工作液質量濃度分別為4.16、8.32、12.48、6.64、20.80 μg/mL，最大吸收波長315 nm。樣品測定：取一定量分散均勻的AEE，加入二倍體積正己烷，于50℃恒溫磁力攪拌水浴鍋中萃取90 min，315 nm處測定上層正己烷吸光度，以正己烷為空白對照。

2 結果與討論

2.1 米糠的特性

米糠經過40目篩去除原料米糠中的米粞，新鮮米糠感官指標性狀如1表所示。

表1 新鮮米糠感官性狀

擠壓膨化米糠：膨化機筒溫度130℃、螺桿轉速160 r/min、模頭孔徑8 mm，出料溫度為90℃，新鮮米糠質量及鈍化全脂新鮮米糠特性見表2所示。

表2 新鮮米糠質量及鈍化全脂新鮮米糠特性 %

通過雙螺桿擠壓膨化后，鈍化全脂新鮮米糠脂肪酶殘余活力降至3.84%，由于米糠脂肪酶的活性已被鈍化，杜絕了后續酶解過程中脂肪酶的酶解，減少了對外加酶的干擾因素。同時擠壓膨化處理，對米糠中的淀粉含量由19.67%，降到了15.38%，擠壓膨化處理對米糠淀粉的影響見表3。

表3中直鏈淀粉含量基本沒有發生變化，支鏈淀粉質量分數則下降了51%，且糊化度明顯提高，表明擠壓膨化機的高溫、高剪切作用劇烈地破壞了淀粉原有的晶體結構，淀粉分子重新排列，由致密結構向疏松結構轉變，有助于后續的酶法提取油脂和蛋白。

2.2 米糠的酶法提油

在堿性蛋白酶、纖維素酶組成的復合酶（1∶1，w/w）添加量2%、酶解時間5 h、酶解溫度50℃、液料比5∶1、pH 6.0的條件下，對鈍化全脂新鮮米糠進行酶解，經離心分離得到稻米油的質量見表4。

表4 稻米油物理化學性質

表4中鈍化新鮮米糠制備的稻米油AV僅為7.45±0.31，說明擠壓膨化極大地鈍化了米糠中的脂肪酶活性，破壞脂肪層的結構，提高了稻米油的品質和貯存的穩定性。一般情況膨化機出料段膨化腔溫度在120～130℃下，既可以使米糠中的脂肪酶、過氧化酶有效失活，又能使米糠中天然抗氧化物質減少，從而使米糠保鮮期延長，也為后續加工提供了優質原油，提油率可達到23.27%。

2.3 米糠酶解物的糖化酶解

將米糠酶解物溶液pH調至3.5，糖化酶的添加量為0.3%，酶解溫度60℃，酶解1.5 h，溶液pH調至4.5，離心分離得到米糠蛋白多肽液，其中總糖含量僅為35.56 mg/g，占3.56%，與使用米糠蛋白粉制備蛋白肽液中總糖含量相當，說明添加糖酶后總糖去除效果明顯。

將米糠蛋白多肽液濃縮，噴霧干燥，得到米糠蛋白多肽，通過分子篩層析確定多肽的分子質量，測定結果如表5所示。

表5 米糠多肽相對分子質量分布 %

由表6可得，在蛋白酶最適條件下進行水解，DH為21.04%，蛋白質回收率為80.13%，實現了米糠的高值化利用。且米糠多肽PDI達到78.5%、NSI為68.6%，說明在前期擠壓膨化過程中米糠蛋白保存率較高，酶解后蛋白質分散較為均一，制備了品質優良的蛋白多肽。

表6 米糠蛋白多肽特性 %

3 結論

以全脂鈍化新鮮米糠為原料，通過酶解同時制得營養豐富的稻米油及米糠蛋白多肽，操作步驟簡便，避免了傳統的強堿對蛋白質的變性破壞，減少了蛋白質提取過程中過多鹽雜質的進入。通過添加糖化酶，降低了水溶性糖類雜質在蛋白產品中的含量，通過生物酶法，同時提取稻米油及米糠蛋白多肽，實現了米糠高值化利用。