乳酸通過GPR81介導(dǎo)的Nrf2／LDHA通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞的遷移

曹玉祥，張志堅(jiān)，周辰康，魏慧君，吳志浩*

（1.皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.安徽省活性大分子研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

肺癌是全球發(fā)病率和病死率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤，目前5年相對(duì)生存率僅為15%［1］，是一種以細(xì)胞異常增殖為特點(diǎn)的疾病之一，造成肺癌患者遠(yuǎn)期生存率較低的主要原因是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。全球80%以上的肺癌死亡病例是由非小細(xì)胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）轉(zhuǎn)移引起的［2］。NSCLC在肺癌中最常見，其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。

G蛋白偶聯(lián)受體81（G protein－coupled receptor 81，GPR81）被鑒定為乳酸的受體［3］，其在脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中高表達(dá)，目前發(fā)現(xiàn)在包括肺癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中同樣高水平表達(dá)［4］，有研究強(qiáng)調(diào)了GPR81在腫瘤生長(zhǎng)和遷移過程中的重要性，在乳腺癌中高表達(dá)的GPR81以PI3K／Akt途徑依賴的方式促進(jìn)增殖并刺激血管生成［5］。Roland等［6］的研究表明GPR81表達(dá)水平與胰腺癌腫瘤生長(zhǎng)速度相關(guān)，抑制GPR81表達(dá)可顯著降低腫瘤生長(zhǎng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)GPR81可以介導(dǎo)肺癌細(xì)胞的侵襲遷移和免疫逃逸［7－8］。

核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2－related factor 2，Nrf2）是一種細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)因子并可以啟動(dòng)細(xì)胞防御機(jī)制，在氧化應(yīng)激和外源性應(yīng)激條件下，能引起Nrf2對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用［9］，防止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而Nrf2不僅可以保護(hù)正常細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量較正常細(xì)胞高，維持腫瘤細(xì)胞的氧化還原平衡狀態(tài)，在保護(hù)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等過程中扮演著重要角色，但 其 分 子 機(jī) 制 并 不 清 楚［10］。乳 酸 脫 氫 酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶之一，對(duì)丙酮酸具有較強(qiáng)的親和力，LDHA的表達(dá)又會(huì)促進(jìn)糖醇解產(chǎn)生大量乳酸［11］。本文探究GPR81介導(dǎo)的乳酸通過Nrf2／LDHA通路促進(jìn)NSCLC遷移的信號(hào)通路，并探索其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 NSCLC細(xì)胞系H1299由上海生科院細(xì)胞庫(kù)提供；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；10%小牛血清購(gòu)自南京博全科技有限公司；基因組DNA提取試劑盒、DNA marker、2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；DNA上樣緩沖液、感受態(tài)大腸桿菌DH5α購(gòu)自日本TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠、2×Leammli Sample Buffer細(xì)胞裂解液、抗β－actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PCR純化試劑盒、質(zhì)粒大量提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ，T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PolyJet轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)SignaGen公司；pGL3－Basic載體、pRL－CMV載體、Passive Lysis Buffer細(xì)胞裂解液、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Nrf2質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Addgene公司；siLDHA、siNrf2購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；紫外分光光度計(jì)、PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Protein Simple公司；抗Nrf2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；抗LDHA抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；Amersham Imager 600成像儀購(gòu)自美國(guó)GE公司，熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)H1299細(xì)胞，培養(yǎng)基中含青霉素、鏈霉素100 U／ml。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染前1 d接種到6孔板（105個(gè)／孔）或者12孔板（5×104個(gè)／孔）中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)Lipofectamine 2000說明書，將siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，在37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)48 h后，用于相關(guān)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將已處理完成的細(xì)胞使用PBS洗滌，加入細(xì)胞裂解液，迅速將細(xì)胞刮下收集細(xì)胞。100℃熱變性5 min，使用10% SDS－PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，5%牛奶室溫封閉1 h，按照1∶1 000比例稀釋并孵育一抗，4℃過夜，按照1∶2 000比例稀釋并室溫孵育二抗1 h，ECL發(fā)光顯影。使用Amersham Imager 600系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)行成像分析，測(cè)定灰度值，用β－actin作為內(nèi)參對(duì)照，來檢測(cè)相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 質(zhì)粒構(gòu)建 用DNA提取試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA，根據(jù)UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫(kù)中Genomic Sequence報(bào)道的人源LDHA基因啟動(dòng)子序列（NR－028500.1）利用oligo 7軟件設(shè)計(jì)單鏈引物，并在上游引物和下游引物中分別添加KpnⅠ和HindⅢ兩種酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下：LDHA－luc（238 bp）上游引物：5′－GGGGTACC ACGTGGAGCAGTCTGCCGGTCGGTTG－3′（下 劃 線 部 分 為KpnⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物：5′－GGGAAGCTT TCG TCGGGGGCGCGTGGCAATGAGAT－3′（下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）；LDHA－luc（1 249 bp）上游 引 物：5′－GGGGTACC GGCAATGGAATCAGCAAGAATACAGG－3′（下劃線部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物：5′－GGGAAGCTT TCGTCGGGGGC GCGTGGCAATGAGAT－3′（下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。經(jīng)擴(kuò)增、酶切、連接、測(cè)序，完成質(zhì)粒構(gòu)建。

1.6 雙熒光素酶活性測(cè)定 LDHA－luc是由LDHA基因啟動(dòng)子控制的表達(dá)螢火蟲熒光素酶的質(zhì)粒，pRL－CMV是由CMV啟動(dòng)子控制的表達(dá)海腎熒光素酶的質(zhì)粒（作為轉(zhuǎn)染效率的對(duì)照）。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，使用PBS洗滌2次，每孔加入Passive Lysis Buffer裂解液100 μl，室溫?fù)u動(dòng)20 min后收取樣品，4℃離心15 min進(jìn)行檢測(cè)。取20 μl上清液與20 μl Luciferase Assay Buffer混合，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的活性；繼續(xù)加入20 μl Stop＆Glo Buffer混合，檢測(cè)海腎熒光素酶活性，計(jì)算2種熒光素酶活性的比值。

1.7 細(xì)胞遷移劃痕實(shí)驗(yàn) 在H1299細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染Nrf2＋control siRNA、Nrf2＋LDHA siRNA，以pcDNA3.1＋control siRNA作為對(duì)照。48 h后，用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化處理，用無(wú)菌的10 μl槍頭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，PBS清洗2次后換上無(wú)血清培養(yǎng)基并一直使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，立即使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍照，記為0 h，每隔24 h拍一次照，分別記為24、48、72、96 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，重復(fù)照相，并計(jì)算平均值。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn) 將0 mmol／L和20 mmol／L乳酸處理過的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后調(diào)整濃度為1×105個(gè)／ml，700 μl含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入Transwell下室，300 μl細(xì)胞懸浮液加入Transwell上室，在37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，吸去廢液，用棉簽擦凈基底膜，PBS清洗，甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色20 min，清水漂洗，顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析作圖，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)；多組均數(shù)的比較采用方差分析，組間比較采用Dunnet t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞遷移劃痕實(shí)驗(yàn)采用Image－Pro Plus 6.0軟件分析細(xì)胞的平均遷移速率。

2 結(jié)果

2.1 乳酸促進(jìn)H1299細(xì)胞的遷移及相關(guān)蛋白水平的上升 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用20 mmol／L乳酸處理過的H1299細(xì)胞穿膜比例明顯高于未處理過的細(xì)胞，是對(duì)照組10倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05） （圖1A、圖1B）；Western blot結(jié)果顯示，不同濃度乳酸處理H1299細(xì)胞，GPR81、Nrf2和LDHA蛋白表達(dá)水平隨著乳酸濃度的遞增而成上升趨勢(shì)（圖1C、圖1D）。

圖1 乳酸促進(jìn)H1299細(xì)胞的遷移及相關(guān)蛋白水平的上升

2.2 GPR81介導(dǎo)乳酸對(duì)Nrf2／LDHA通路的上調(diào)

Western blot結(jié)果顯示，在H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GPR81 siRNA，Nrf2和LDHA的蛋白表達(dá)水平明顯下降，同時(shí)也觀察到p－AKT蛋白水平的降低（圖2A、圖2B）；當(dāng)在H1299細(xì)胞中加入PI3K－AKT通路抑制劑LY294002時(shí)，p－AKT蛋白水平降低，Nrf2和LDHA蛋白表達(dá)水平隨之降低（圖2C、圖2D）。

圖2 GPR81介導(dǎo)乳酸對(duì)Nrf2／LDHA通路的上調(diào)

2.3 Nrf2對(duì)LDHA促進(jìn)作用的分子機(jī)制 Western blot結(jié)果顯示，在H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA，不同濃度乳酸處理，LDHA蛋白表達(dá)水平降低，并隨著乳酸濃度的遞增而成上升趨勢(shì)（圖3A、圖3B）；構(gòu)建完成不同片段長(zhǎng)度的LDHA啟動(dòng)子質(zhì)粒LDHA－luc（1 249 bp）和LDHA－luc（238 bp）（圖3C、圖3D）；在H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1＋LDHA－luc（238 bp）、Nrf2＋LDHA－luc（238 bp）、pcDNA3.1＋LDHA－luc（1 249 bp）和Nrf2＋LDHA－luc（1 249 bp），與對(duì)照組相比，Nrf2對(duì)LDHA啟動(dòng)子活性有促進(jìn)作用，并且LDHA－luc（1 249 bp）活性比LDHA－luc（238 bp）活性高（圖3E）。

圖3 Nrf2對(duì)LDHA促進(jìn)作用的分子機(jī)制

2.4 LDHA的表達(dá)影響H1299細(xì)胞的遷移速率細(xì)胞遷移劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Nrf2＋LDHA siRNA實(shí)驗(yàn)組的遷移速率明顯比轉(zhuǎn)染Nrf2＋control siRNA實(shí)驗(yàn)組的遷移速率慢（圖4A）；且在96 h內(nèi)的平均遷移速率分別為（15.4±0.5）μm／d、 （38.7±0.5）μm／d和（19.0±0.5）μm／d（圖4B）。

圖4 LDHA的表達(dá)影響H1299細(xì)胞的遷移速率

3 討論

肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的動(dòng)態(tài)過程是多因素、多環(huán)節(jié)、連續(xù)漸進(jìn)的，涉及到多個(gè)基因的突變和功能變化，引起許多信號(hào)通路功能的異常，進(jìn)而引發(fā)有助于腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)［12］。有研究顯示，腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移與腫瘤微環(huán)境中乳酸的不斷積累有密切聯(lián)系［13］。有氧糖酵解是由腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因突變而誘發(fā)的代謝重編程，即在氧氣充足條件下，將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，而不是進(jìn)入三羧酸循環(huán)［14］，其主要功能是使糖酵解產(chǎn)物通過旁路途徑合成核酸、蛋白質(zhì)及脂肪酸的前體［15］，從而滿足腫瘤生長(zhǎng)的需要，在腫瘤細(xì)胞遷移過程中起了關(guān)鍵作用。Nrf2作為對(duì)氧化還原敏感的核轉(zhuǎn)錄因子，在受到氧化劑等物質(zhì)刺激時(shí)，會(huì)由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，啟動(dòng)ARE調(diào)控氧化應(yīng)激蛋白和多種Ⅱ相解毒酶基因轉(zhuǎn)錄［16］。從而探索Nrf2對(duì)LDHA的誘導(dǎo)為進(jìn)一步探索腫瘤代謝和微環(huán)境對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響做出了鋪墊。

在高濃度的乳酸環(huán)境中，乳酸水平的穩(wěn)定是靠單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MCTs）來調(diào)控。在體外模擬腫瘤微環(huán)境，當(dāng)用乳酸作為癌細(xì)胞的主要能源時(shí)，GPR81表型缺失的癌細(xì)胞，對(duì)乳酸水平變化不敏感，線粒體活性受到抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖受到影響，而正常的癌細(xì)胞中，MCTs和過氧化物酶體增殖物激活受體－γ共激活因子－1α（PGC－1α）的水平相應(yīng)增加［6］，因此，GPR81在癌細(xì)胞的生存中起重要作用。本文將GPR81作為乳酸介導(dǎo)Nrf2／LDHA信號(hào)通路的關(guān)鍵因素進(jìn)行探索研究，并進(jìn)行了證明。

綜上所述，本研究通過乳酸對(duì)H1299細(xì)胞遷移的影響，探索了核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對(duì)LDHA促進(jìn)作用的分子機(jī)制，進(jìn)而明確了乳酸通過GPR81調(diào)控Nrf2／LDHA的信號(hào)通路，為后期臨床癌細(xì)胞侵襲遷移的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。