QuEChERS/超高效液相色譜－串聯質譜法檢測果酒中14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑

黃笑晨，李 昆，李 朔，郭愛靜，王 可，*，楊莉麗

（1．河北師范大學 化學與材料科學學院，河北 石家莊 050024；2．石家莊市疾病預防控制中心 石家莊市化學毒物檢測及風險預警技術創新中心，河北 石家莊 050011）

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一類以天然抗生素Strobilurin A為先導化合物開發的新型殺菌劑，其通過抑制細胞色素b和細胞色素C1之間的電子傳遞，阻礙菌類的線粒體呼吸，抑制三磷酸腺苷（ATP）生成，從而達到殺菌作用［1－2］。該類殺菌劑能有效防治子囊菌、擔子菌、半知菌和卵菌等真菌引起的病害，因具有低毒、廣譜、高效等特點，被廣泛應用于現代農業生產中［3］。自1996年上市以來，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑已開發了十幾個品種，并于2014年以37．43億美元的銷售額成為全球第一大殺菌劑［4］。然而研究表明，嘧菌酯、啶氧菌酯和氟嘧菌酯在施藥后易進入土壤中沉積，不易降解，對土壤生態環境造成潛在威脅［5－7］。該類殺菌劑還可通過地表徑流、滲透作用等對水體環境造成污染，導致水生生物繁殖力下降并有致畸性［8－11］。因此，該類殺菌劑對人體健康的潛在危害不容忽視。

在果蔬的生產過程中，常施用大量殺菌劑保證產量和品質，殺菌劑殘留不可避免地會對果蔬制品（如果酒）造成污染，進而通過人們的攝入在體內累積，對人類健康產生不良影響。目前，該類殺菌劑的研究對象多見于果蔬、水體和土壤等，關于果酒中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留分析鮮有報道。因此建立果酒中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的快速、高效的檢測方法，對于保障食品質量安全和人民身體健康具有重要意義。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）［12］、氣相色譜－串聯質譜法（GCMS/MS）［13］、高效液相色譜法（HPLC）［14］、液相色譜－串聯質譜法（LC－MS/MS）［15－17］。其中，LC－MS/MS法由于具有定性準確、靈敏度高、抗干擾能力強等特點，提升了復雜基質中農藥多殘留分析的能力，被廣泛應用于農獸藥的殘留檢測。王巖松等［18］利用LC－MS/MS法測定了葡萄酒中10種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，但該法采用固相萃取凈化，操作較繁瑣，耗時較長。本研究采用QuEChERS結合超高效液相色譜－串聯質譜（UPLC－MS/MS）建立了同時測定果酒中14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的檢測方法。該方法操作簡便、高效快速、靈敏度高，為果酒中該類殺菌劑的殘留檢測提供了技術手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Exion－TRIPLE QUAD 5500型超高效液相色譜串聯質譜儀（美國AB SCIEX公司）；AE240電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli－Q超純水機（美國Millipore公司）；C3 I型臺式離心機（法國JOUAN公司）；T－460/H超聲清洗器（德國Elma公司）；EVAP－12型氮吹儀（美國Organomation公司）；MS2型渦旋振蕩器（德國IKA公司）。

吡唑醚菌酯、氟嘧菌酯、嘧菌酯、嘧菌胺、烯肟菌酯（100μg/mL，純度99．0%，北京曼哈格生物科技有限公司）；醚菌胺、肟醚菌胺、醚菌酯、啶氧菌酯、Z-苯氧菌胺、E-苯氧菌胺（100μg/mL，純度99．0%，天津阿爾塔科技有限公司）；肟菌酯、烯酰嗎啉、嘧霉胺（純度＞99．0%，Dr．Ehrenstorfer GmbH公司）。甲醇（美國Fisher公司）、乙腈（美國Sigma－Aldrich公司）均為色譜純；N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（GCB）（美國Dikma公司）；C18（40～50μm，美國Welch公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純，天津永大化學試劑有限公司）；實驗用水為Milli－Q超純水。果酒樣品（葡萄酒、柚子酒、石榴酒等）購自石家莊市內超市。

1.2 標準溶液的配制

取適量各標準溶液，用乙腈定容至10 mL棕色玻璃瓶中，得到1 mg/L的混合標準儲備溶液，避光儲存于－20℃冰箱中。用乙腈逐級稀釋混合標準儲備溶液，配制0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0、50．0、100．0μg/L的系列混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取4 g果酒樣品（精確至0．01 g）于50 mL離心管中，加入8 mL乙腈，渦旋提取60 s，然后加入0．5 g NaCl，渦旋混勻，以4 000 r/min離心5 min，取6 mL上清液加入到含有200 mg C18和600 mg無水MgSO4的15 mL離心管中，渦旋混勻后以8 000 r/min離心5 min。吸取4 mL上清液，在45℃下氮吹濃縮近干，再用1 mL乙腈溶解殘渣，過0．2μm濾膜上機檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex F5（3．0 mm×100 mm，2．6μm）；流動相：A為水，B為乙腈；流速：0．3 mL/min；進樣量：3μL；柱溫：40℃。梯度洗脫程序：0～4 min，45%B；4～4．1 min，45%～55%B；4．1～5．0 min，55%B；5．0～5．1 min，55%～65%B；5．1～9．5 min，65%B；9．5～9．6 min，65%～45%B；9．6～13．0 min，45%B。

1.4.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式；監測模式：多反應監測（MRM）；離子源電壓：5 500 V；離子源溫度：500℃；氣簾氣（N2）壓力：275．8 kPa；霧化氣（N2）壓力：344．75 kPa；輔助加熱氣（N2）壓力：344．75 kPa。14種殺菌劑的質譜參數見表1。

表1 14種殺菌劑的色譜保留時間與質譜參數Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters of 14 fungicides

2 結果與討論

2.1 質譜參數的優化

分別配制50 ng/mL的14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標準溶液，采用針泵恒流進樣，在正離子模式下，首先利用全掃描模式（Q1 MS）尋找目標物的母離子；然后對母離子進行產物離子掃描（Product ion，MS2），選擇2個響應信號較強的碎片離子（其中響應值高的作為定量離子，另1個選為定性離子）；再將母離子和這2個碎片離子組成檢測離子對，在MRM模式下對每個化合物的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進行優化，14種化合物的質譜參數見表1。

2.2 色譜條件的優化

考察了乙腈－水和甲醇－水分別為流動相對14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑分離效果的影響。結果顯示，乙腈－水作為流動相時的靈敏度高于甲醇－水，峰形較好，響應值高，且分離效果好。以乙腈為有機相，進一步考察了分別以純水、0．1%甲酸水溶液、含2 mmol/L乙酸銨的0．1%甲酸水溶液為水相時的分離效果，發現加入甲酸后14種殺菌劑的峰形雖有改善，但多數化合物的響應受到抑制，此外加入乙酸銨對分離效果的影響較小。綜上，最終選擇乙腈－水為流動相，14種殺菌劑標準溶液（50μg/L）的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 14種殺菌劑標準溶液（50μg/L）的總離子流色譜圖Fig．1 Total ion current chromatogram of the 14 fun?gicide standard solution（50μg/L）1．Z-metominostrobin；2．E-metominostrobin；3．dimetho?morph；4．pyrimethanil；5．orysastrobin；6．azoxystrobin；7．mepanipyrim；8．dimoxystrobin；9．fluoxastrobin；10．kresoxim-methyl；11．picoxystrobin；12．pyraclostrobin；13．trifloxystrobin；14．enestroburin

2.3 樣品前處理條件的優化

2.3.1 提取條件的優化 根據14種殺菌劑的結構和理化性質，考察了乙腈、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚作為提取溶劑時的提取效果。結果表明，以乙腈為提取溶劑時14種殺菌劑的回收率為68%～95%；丙酮、乙酸乙酯和石油醚的提取效果較差，14種殺菌劑的回收率普遍在75%以下；二氯甲烷的密度較大，分層后有機相在下層，不易吸取，且14種殺菌劑的回收率（63%～93%）略低于乙腈，故選擇乙腈作為提取溶劑。向一定量的空白樣品（加標水平為10μg/kg）中分別加入6、8、10、12、14 mL的乙腈，考察了乙腈用量對加標回收率的影響。結果顯示：當乙腈用量為8 mL時，14種殺菌劑的回收率較好，均在65%以上；雖然乙腈用量為14 mL的回收率略好于8 mL時，為節約試劑，最終選擇8 mL乙腈作為提取溶劑。通過比較樣品經超聲提取和渦旋提取的效果，發現渦旋提取的效果優于超聲提取。進一步對渦旋時間（30、60、90 s）進行比較，發現渦旋提取60 s時14種殺菌劑的回收率最好，因此實驗選擇渦旋提取時間為60 s。

2.3.2 凈化條件的優化 QuEChERS方法的凈化填料主要包括無水MgSO4、Na2SO4、C18、PSA和GCB等，其中無水MgSO4和Na2SO4為常見的吸水劑。PSA（去除基質中的脂肪酸、有機酸、碳水化合物和少量色素等）、C18（去除非極性和脂肪性物質）、GCB（去除色素、甾醇類和非極性干擾物）為常見的吸附劑［19］。分別比較了單獨使用PSA、C18、GCB、無水MgSO4以及PSA+無水MgSO4、C18+無水MgSO4、PSA+C18+無水MgSO4組合使用情況下的凈化效果。實驗發現，GCB對果酒中色素的去除效果較好，但對待測化合物的吸附較為嚴重。由圖2可知，PSA的凈化效果比C18差，而C18+無水MgSO4對14種殺菌劑的回收率較其他條件下更好，最終確定C18+無水MgSO4作為凈化劑。

圖2 不同凈化劑對14種殺菌劑回收率的影響Fig．2 Effect of different purificants on the recoveries of 14 fungicides

進一步對凈化劑的用量進行優化，首先固定無水MgSO4的用量為300 mg，考察了C18用量（100、200、300、400 mg）對凈化效果的影響，結果表明C18用量為200 mg時的凈化效果最好，14種殺菌劑的回收率為71．0%～107%。固定C18用量為200 mg，考察了無水MgSO4用量（300、400、500、600、700 mg）對凈化效果的影響，發現隨著無水MgSO4用量的增加，14種殺菌劑的回收率不斷提高，但當無水MgSO4的用量超過600 mg時，回收率開始下降，故選擇200 mg C18+600 mg無水MgSO4作為凈化劑。與文獻采用的固相萃取法［18］相比，本文優化后的QuEChERS法不僅簡便，且各殺菌劑的回收率較好，均在75%以上。

2.4 基質效應

基質效應（Matrix effect，ME）是指基質成分和目標分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響，使用ESI檢測時，基質主要影響目標化合物的離子化，使其響應信號增強或減弱，從而形成基質增強或抑制效應。采用同一質量濃度待測物在基質溶液與溶劑中峰面積的比值評價基質效應［20－21］，ME越接近100%，表明基質效應越小。將空白樣品按“1．3”方法處理得到基質提取溶液，比較了質量濃度分別為10、20、50μg/L情況下14種殺菌劑在果酒基質中的基質效應，14種殺菌劑的ME為80．6%～119%，表明基質效應較小可忽略，所以采用溶劑標準曲線進行定量分析。與文獻方法［18］相比，本方法消除了氟嘧菌酯和醚菌胺的基質效應，對果酒基質的凈化效果更好。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

按“1．2”方法配制質量濃度為0．1～100．0μg/L的混合標準工作溶液，在優化條件下進行測定，以標準溶液的質量濃度（x，μg/L）為橫坐標，目標物的峰面積（y）為縱坐標，得到相應的線性方程，再分別以3倍信噪比（S/N=3）確定檢出限（LOD），以S/N=10確定定量下限（LOQ）。結果顯示，14種殺菌劑在各自的質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數（r2）均大于0．999，LOD和LOQ分別為0．002～0．723μg/kg和0．006～2．409μg/kg（表2）。

表2 果酒中14種殺菌劑的線性關系、檢出限、定量下限、回收率及相對標準偏差Table 2 Linear relations，LODs，LOQs，recoveries and RSDs of 14 fungicides in fruit wines

2.6 回收率與相對標準偏差

取空白果酒樣品，分別在5、10、50μg/kg 3個濃度水平下進行加標回收實驗，每個水平平行測定7次，按照本方法進行測定。結果顯示，14種殺菌劑的平均回收率為71．2%～99．1%，相對標準偏差（RSD）為0．30%～9．4%（見表2）。

2.7 實際樣品測定

采用本方法對市售的7份葡萄酒和8份水果酒樣品進行檢測，其中有6份樣品檢出烯酰嗎啉，5份樣品檢出嘧霉胺，2份樣品檢出嘧菌酯（見表3）。目前，《GB 2763－2019》［22］尚未對果酒中該類殺菌劑的限量進行要求，故參照其在對應水果中的限量要求（烯酰嗎啉：葡萄為5 mg/kg；嘧霉胺：葡萄、桃為4 mg/kg，柚子為7 mg/kg；嘧菌酯：葡萄為5 mg/kg），所測樣品的檢出值均小于國家限量標準。表明本方法適用于果酒中14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留檢測。

表3 實際樣品的檢測結果Table 3 Test results of real samples

3 結 論

本研究建立了同時檢測果酒中14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的UPLC－MS/MS方法。實驗對質譜條件、色譜條件和樣品前處理條件進行了優化，并考察了基質效應的影響。結果表明，該方法操作簡便、靈敏度高、精密度好、線性關系良好，適用于果酒中14種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留檢測。