基因擴增檢測方法對結核性胸腔積液的診斷價值分析

王 建，王佃成，張 盟，勞海黎，孫義軍

（濱州市中心醫院檢驗科 山東 濱州 251700）

結核病中肺臟是最常見的發病器官，結核性胸腔積液（tuberculous pleural effusion, TPE）是肺結核的一種常見類型。醫院常規使用涂片抗酸染色鏡檢和羅氏培養不僅檢敏感性較低[1-2]，所需時間過長，胸膜活檢陽性率高但是為有創性檢查[3]，導致臨床醫生早期只能通過經驗和診斷性治療來診斷TPE，可能導致誤診或者延誤診斷，因此應該在疾病的早期尋找準確有效的檢測方法，提高TPE患者的診斷準確率。本次采用基因擴增檢測、涂片鏡檢及羅氏培養三種檢測方法對胸膜結核患者的胸腔積液進行檢測，分析三種方式診斷效能及臨床價值，為優化診斷結核性胸膜炎提供參考。現報告如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年9月—2020年9月我院收治的結核性胸腔積液患者98例。（1）納入標準：符合《臨床診療指南—結核病分冊》診斷標準確診為結核性胸腔積液的患者。（2）排除標準：①經過超聲定位不需要進行胸腔積液穿刺患者；②患有其他心、腦、腎疾病不能抽取積液患者。此次男性患者63例，年齡45～68歲，均齡59歲；女性患者25例，年齡48～64歲，均齡57歲。其中有5例患有HIV。所有患者及家屬都知曉并且已經簽署了知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑

TL988實時熒光定量PCR儀（西安天隆科技有限公司）、FZP-1核酸提 純儀（上海仁度生物科技有限公司）；結核分枝桿菌核酸檢測（RNA恒溫擴增法）試劑盒（上海仁度生物科技有限公司）；ABI7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）,結核分枝桿菌核酸檢測（PCR-熒光法）,羅氏固體培養基和對硝基苯甲酸（p-Nitrobenzoic acid, PNB）培養基（珠海銀科醫學工程有限公司）。

1.3 標本處理

根據標本標識程序SOP進行樣本編號，嚴格按照《結核病診斷細菌學檢查規程》對98例患者的標本進行操作[4]，采用NaOH-乙酰半胱胺氨酸法對標本進行固定，去上清，離心的沉淀物加入0.9%氯化鈉溶液懸浮。

1.3.1 PCR用移液槍取5 mL樣本放入試管中，在試管中加入4%氫氧化鈉溶液20 mL，緩慢搖動直至均勻，在室溫下把試管放置30 min，取1.0 mL的液體，再進一步用離心機進行離心分離，經15 000 r/min離心后。去上清，然后沉淀，沉淀中加入無菌0.9%氯化鈉溶液1 mL，再以15 000 r/min離心5 min,再進行重復沉淀，其中，要再加入DNA提取液搖勻，經10 000 r/min離心5 min，將上清液去除后進行PCR反應，記錄檢測結果。取1.0 mL的樣本放入試管中，用離心機經15 000 r/min離心后。去上清，沉淀加入50微升DNA提取液充分混勻，沸水浴10 min。10 000 r/min離心5 min，取上清液2微升做PCR反應，記錄檢測結果。

1.3.2 涂片鏡檢 用移液槍取5 mL,用離心機離心15 min，去上清，加入兩倍的氫氧化鈉處理，渦旋振蕩，沉淀30 min后，加入pH 6.8的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）至50 mL，再次離心，去上清，沉淀物中加入1 mL PBS混勻。然后吸取0.1 mL混勻，沉淀涂在玻片正面的中心處，將標本固定好，然后涂抹成圓形或者橢圓形，再用火的外焰固定，抗酸染色鏡檢。

1.4 觀察指標

以試劑盒自帶的陰性、陽性對照作為質控記錄基因擴增陽性結果；觀察涂片在顯微鏡下是否呈現出紅色，并記錄陽性反應；培養基內若滿8周仍無細菌生長，即報告培養陰性。

1.5 統計學方法

數據采用SPSS 22.0統計軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 三種方法檢測TPE結果

基因擴增法陽性率56.12%，涂片鏡檢陽性率29.59%，羅氏培養陽性率25.51%，三組方法檢測TPE陽性率結果差異有顯著意義，見表1。

表1 三種方法檢測TPE陽性率的兩兩比較[n（%）]

3.討論

胸腔積液疾病的致病原因中10%～30%為結核性胸膜炎，結核性胸膜炎占到肺結核病的大多數[5]，其診斷通常依靠胸部穿刺取得胸水鑒別診斷或是胸膜切片以獲取病理學[6]或細菌學證據。結核性胸膜炎實驗室診斷主要的病原學診斷，包括快速培養、痰涂片抗酸染色、結核DNA等方法，但由于胸膜腔的無菌性特征，其涂片和培養的陽性率都很低檢查的陽性率均不高，而且特異性較差。目前大多數病例還是通過臨床癥狀和胸水積液常規檢查進行診斷。但是對于結核性胸膜炎患者而言，越早確定診斷，不僅對患者的治療和管理有很大的幫助，而且對公共健康和流行病學具有重要意義。胸腔積液Xpert MTB/RIF檢測和γ-干擾素釋放分析試驗均為近年來試用于臨床的新的結核性胸膜炎檢測方法，不僅有助于對結核病患者的早期快速診斷，而且還能快速測定結核耐藥基因（如Gene Xpert MTB/RIF），對于肺結核具有較高的診斷價值[7-8]，被WHO首要推薦用于結核病診斷。然而對于胸腔這種處于無菌體腔的環境中的體腔，有文獻報道病原學診斷如培養和GeneXpert MTB/RIF等檢出率均不高，但是病原學陰性的胸腔積液并不意味著就排除結核性胸膜炎，臨床上尚有很多病原學陰性的病例[9]。有研究顯示對結核疾病的早期診斷和篩查，臨床上多采用聯合檢測能在早期提示診斷，顯著提高陽性檢出率，并且應用聯合檢測還可減少肺結核疾病的漏診率[6]。因此，本文從臨床確診的98例結核性胸腔積液入手，采用基因擴增檢測、涂片鏡檢及羅氏培養三種檢測方法對胸膜結核患者的胸腔積液進行檢測，評價三種方法對TPE的診斷效能為結核性胸膜炎早期診斷提供特異、靈敏的檢測方法。

結果顯示，基因擴增法陽性率56.12%，涂片鏡檢陽性率29.60%，羅氏培養陽性率25.51%，三種方法檢測TPE陽性率結果差異有顯著意義（P＜0.05）?；驍U增檢測法陽性率高于涂片鏡檢法，差異有顯著意義（P＜0.05），基因擴增檢測法與羅氏培養陽性率比較，差異有顯著意義（P＜0.05），雖然涂片鏡檢檢測者陽性率高于羅氏培養，但差異無統計學意義（P＞0.05）。觀察結果我們可以發現，基因擴增檢測法對于結核性胸膜炎的診斷和鑒別具有十分重要的作用，尤其需要進行胸腔積液穿刺緩解癥狀的患者和一些涂片陰性肺結核的患者，可以滿足日常醫生對肺結核的快速診斷，相比較其他的方法具有特異性強和敏感度高的優點。

分析涂片抗酸桿菌陰性而基因擴增和培養陽性的病例時，發現應用涂片抗酸桿菌鏡檢比較難以檢測出陽性反應，因為在抗酸染色時標本難易固定。即使在實驗過程中進行了一系列嚴格操作降低了假陰性率，觀察時還可能因為鏡檢不夠仔細而觀察不到分枝桿菌造成標本的漏診。所以把涂片抗酸桿菌鏡檢陽性作為臨床治療的依據，會使一些沒有痊愈的患者對療效的判斷出現誤差，也會造成患者不規律用藥，降低患者依從性，從而也會讓結核桿菌對普通的藥物產生耐藥性[10]。羅氏培養法雖然也可以在臨床上使用，但是，對于一些要求快速診斷的結核病患者難以滿足臨床需求且操作難度比較大。發現采用羅氏培養的胸腔積液的陽性率最低，也從中驗證了細菌難易透過胸膜進入胸腔中，所以胸腔積液細菌含量少的說法?；驍U增檢測法的檢出率要高于涂片和羅氏培養法，對于一些菌陰肺結核可以發揮出更大的診斷作用，確保不遺漏有傳染性的肺結核患者。對于胸腔積液患者可以反映出結核桿菌數量的多少，也有助于臨床上用藥的選擇。

綜上所述，對比涂片鏡檢和羅氏培養法，基因擴增檢測法對結核性胸腔積液的診斷方面具有十分重要的作用，值得我們在臨床中應用。