基于SARS-CoV-2 RdRp潛在變構位點小分子擬肽類抑制劑的篩選*

毛 輝，儲春霞，朱秋莎，孟 詩，周 雪，顧明星，費 翔，袁 月△

（1.金華職業技術學院，浙江 金華 321007； 2.南京盛德瑞爾醫藥科技有限公司，江蘇 南京 210047；3.韓國嘉泉大學，仁川 21936）

冠狀病毒（CoV）是一類廣泛存在的、對人類和家畜均有重大潛在威脅的病原微生物，最初于1937年在雞的感染組織中被發現。2003年暴發的重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS－CoV）疫情在全球共有約8 000例感染病例，死亡率約為10%，高致死率及特效藥物的缺乏引起了全球恐慌。2019年12月暴發的新型冠狀病毒肺炎（COVID－19）疫情由新型冠狀病毒（SARS－CoV－2）引起，SARS－CoV－2與SARS－CoV具有高度同源性，截至2020年6月10日，全球已有確診病例超過700萬，死亡病例超過40萬[1－3]。SARS－CoV－2的主要傳播途徑是呼吸道飛沫傳播和接觸傳染，但目前尚無專門針對SARS－CoV和SARS－CoV－2的治療藥物。本研究中探討了SARS－CoV－2 RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）抑制劑的篩選。病毒RdRp主導完成CoV的基因組復制過程，可準確、高效地實現數萬個核苷酸的合成。一線醫護人員和科研工作者們在藥物篩查中發現，抗埃博拉病毒的藥物瑞德西韋（remdesivir）的直接作用靶點為RdRp（見圖1 A）[4]。吉利德公司研究發現的抗丙型肝炎病毒（HCV）藥物索非布韋，為NS5B核苷類聚合酶抑制劑（NPI），競爭作用于NS5B的催化活性位點，插入到新合成的核苷酸鏈中以阻斷HCV的生命周期（見圖1 B，來自PDB文件4WTG）[5]。但還有另一類非核苷類聚合酶抑制劑（NNPI），以非競爭方式與NS5B聚合酶催化部位的變構位點結合，導致蛋白重要構象發生改變，干擾病毒的體內復制過程，目前至少有5個變構位點可作為NNPI藥物的靶點（NNPI－1～NNPI－5，見圖2，分別來自PDB文件1OS5，1YVF，2BRK，3FQL，1GX6）[6]。故考慮，CoV RdRp除了瑞德西韋所在結合位點外，可能也存在變構位點。

圖1 抗病毒藥物作用位點A.Remdesivir B.SofosbuvirFig.1 Action sites of antiviral drugs

圖2 NS5B聚合酶的變構位點A.PDB 1OS5 B.PDB 1YVF C.PDB 2BRK D.PDB 3FQL E.PDB 1GX6Fig.2 NS5B polymerase allosteric site

1 材料與方法

1.1 虛擬篩選軟件與材料

本研究中虛擬篩選軟件選用Maestro（Schrodinger 2020－2），蛋白質晶體結構均來自PDB數據庫（https：//www.rcsb.org），化合物結構來自Npatla公司提供的化合物庫，其為以細菌和真菌代謝產物為主體的擬肽化合物小分子庫，共有2.4萬個化合物。

1.2 方法

1.2.1 SARS－CoV－2－RdRp蛋白晶體結構的處理

RdRp蛋白的三維晶體結構可從PDB數據庫下載獲得，PDB代碼為7BV2，晶體結構分辨率為2.5?，為nsp12－nsp7－nsp8復合物，包含RNA鏈和磷酸形式的瑞德西韋結構。用Maestro軟件的“protein preparation wizard”對7BV2結構進行修正化學鍵序，加氫，處理金屬離子，補齊缺失的原子與氨基酸殘基，刪除多余的分子等，然后在OPLS力場條件下對蛋白進行能量優化，最終以此作為分子對接的受體。

1.2.2 藥物結合位點

7BV2是由nsp12－nsp7－nsp8復合物和模板引物RNA組成的復雜復合物，在處理蛋白時僅保留nsp12肽鏈。為了偵測nsp12潛在的結合位點，使用靶點預測在線平臺FTmap（http：//ftmap.bu.edu/login.php）和Maestro中的site map板塊偵測目標蛋白潛在的結合口袋。采用一致性高的預測結果，以提升靶點結合口袋預測的可靠性。其中FTmap在線平臺產出可結合小分子抑制劑的潛在活性口袋，并進行打分排序，而Maestro軟件中的site map可在預測小分子結合口袋并打分排序的同時，給出各活性口袋相關氫鍵供受體及疏水空間等信息。本研究中，Maestro軟件的site map及FTmap給出的預測結果一致性高，其中打分排名靠前的位點依次為位點1、位點2、位點3（見圖3）。

圖3 FTmap及Maestro預測結合位點A.Site 1 B.Site 2 C.Site 3Fig.3 Predicted binding sites by FTmap and Maestro

其中，結合位點1為本研究使用的高通量虛擬篩選位點，結合位點2為底物位點，也是瑞德西韋活性代謝物的結合位點。位點1、位點3未見相關報道。本研究中基于FTmap和Maestro一致性預測的結果，選擇排名優先的位點1進行高通量篩選。后續研究中，計劃探討位點3作為靶點結合位點的可能性。

當圖1中的位點確定后，以Maestro中Grid Generation模塊，基于預測位點1中心處氨基酸殘基為中心，建立邊長為20?的網格，作為活性口袋對接中心，對接網絡見圖4。

圖4 以預測位點為中心的對接網絡Fig.4 The docking netwokd established with the predicted sites as the center

結果顯示，存在2個主要結合位點，一是瑞德西韋代謝活性物結合位點，組成口袋的關鍵氨基酸殘基為LYS545，SER682，ASP623，THR687，SER759，ASP760，ASN691等；二是靠近此位點邊上的結合位點（潛在變構位點），組成該口袋的關鍵氨基酸殘基為PHE165，PRO169，ASP170，LEU172，ARG173，THR246，LEU247，ARG249，TYR265，THR319，PRO323，THR324，ARG349，LEU389，ASP390，LYS391，THR393，THR394，PHE396，ARG457，TYR458，LEU460，PRO461，THR462，PRO677等。2個結合位點的位置見圖5，本研究中主要闡述潛在的變構位點。

圖5 RdRp蛋白上2個對接位點Fig.5 Two docking sites on RdRp protein

1.2.3 化合物庫選擇

最新（截至本文投稿時）幾篇刊載于Science和Nature的文章指出，抗SARS－CoV－2的基本都是擬肽類化合物[4，7－8]。借助Npatla公司提供的化合物庫建立了包含大量肽樣化合物的以細菌和真菌的代謝產物為主體的化合物庫，借助計算機輔助藥物設計（CADD）方法，對RdRp抑制劑進行了分子對接研究。

1.2.4 化合物結構處理

運用軟件中的“Ligprep”模塊對化合物分子進行優化處理。

1.2.5 分子對接

采用“Receptor Grid Generation”模塊，以潛在變構位點為中心生成格點文件。以7BV2作為剛性受體，各配體分子作為柔性配體，進行半柔性對接。采用“Ligand Docking”模塊進行高通量虛擬篩選，以docking score打分值作為初步篩選條件，再對打分靠前的化合物進行標準對接。

初篩以Maestro軟件中提供的HTVS對接方式進行，該方法篩選速率較快，同時具備一定的對接精度。之后對于打分排序靠前的化合物，通過Maestro軟件中的標準模式（SP）對接進行確認。因基于高通量篩選數據龐大，故未在文中一一列舉。

2 結果

AR00455小分子表現出極高的親和力，化學結構見圖6。化合物AR00455是一種細菌素，最早是由從魚內臟中分離出來的乳酸菌（肉食桿菌屬V41）的代謝產物中分離得到[9]。該化合物docking score打分值為－11.101 kcal/mol，能完美占據RdRp潛在的變構位點。AR00455小分子的Lys2－Tyr3氨基酸片段伸向活性位點深處，其中Lys2被PHE165，PRO169，ARG457，TYR458等氨基酸殘基包圍，Tyr3被THR246，LEU247，LEU460，PRO461，THR462等氨基酸殘基包圍；近肽鏈末端的Tyr9片段處于由LEU389，ASP390，LYS391，THR393等殘基構成的口袋中；Tyr4－Gly5－Asn6－Gly7－Val8肽鏈片段折疊在空腔表面；肽鏈末端的特殊含硫結構片段處于由THR393，THR394，PHE396等殘基構成的口袋中（見圖7）。

圖6 AK00455小分子的化學結構Fig.6 Chemical structure of AK00455 small-molecule

圖7 AR00455抑制劑的化學結構和口袋模型Fig.7 Chemical structure and pocket model of AR00455 inhibitor

AR00455與RdRp蛋白復合物單個氨基酸殘基能量分解分項值見表1。可見，配體與大多數氨基酸殘基之間的范德華力差異不大，范德華相互作用能主要由A323，A319，A461，A460，A249，A396等殘基參與。A665和A350的靜電能項是負值，且值較大，有助于配體和受體相互作用，其余尤其是A676，A457，A349的靜電相互作用能對復合物的結合有阻礙作用。

3 討論

對于COVID－19，目前仍無特效藥，治療藥物的選擇多基于SARS或其他流感病毒的治療經驗，安全、有效和經濟的抗病毒藥物研發迫在眉睫[10]。

SARS－CoV－2靶標眾多，研發人員目前研究較多的靶點是血管緊張素轉換酶2（ACE2）、主蛋白酶（Mpro）3CL和RdRp。SARS－CoV－2識別宿主細胞是通過S蛋白的受體結合區（RBD）與宿主表面特異表達的受體分子的識別來實現的。研究表明，ACE2為CoV S蛋白的受體，在病毒進入宿主細胞前S蛋白會被宿主表面蛋白酶TMPRSS2水解成S1和S2兩段，S1負責識別ACE2，S2負責融合宿主細胞[11]。所以在CoV入侵過程中，寄主細胞表面的ACE2和TMPRSS2蛋白扮演了重要角色。但ACE2在人體內有同源性蛋白，且廣泛分布于心臟、腎臟、睪丸、脂肪組織、腦組織、血管平滑肌細胞、胃腸道等，在治療過程中，抑制ACE2蛋白類藥物可能會對人體造成不可估計的副作用[12]。

Mpro屬半胱氨酸水解酶，是CoV的主要蛋白酶之一，負責切割病毒基因組翻譯的蛋白前體，得到多個非結構蛋白，由這些非結構蛋白組裝形成病毒的復制－轉錄酶復合體，病毒才能完成正常的轉錄和復制，是抗CoV藥物設計過程中的重要靶標[13]。國內外學者已對此做了大量研究。[14]團隊篩選發現，美國食品和藥物管理局批準的硫醇反應藥物中，抗酒精藥物戒酒硫及其巰基反應衍生物與靶點蛋白3CL pro親和力最高，且與CYS145發生氫鍵作用，具有病毒臨床治療潛力。朱云鵬[15]通過體外抑制活性試驗篩選獲得5個抑制SARS－CoV主蛋白酶活性較強的化合物，并運用抑制動力學研究及分子對接等方法探討其抑制機制，結果發現，其中4個化合物能與SARS－CoV－Mpro催化活性中心的Cys－145形成共價鍵，為不可逆抑制劑，1個化合物能與SARS－CoVMpro的Asn－142，Gly－143，Gln－189形成氫鍵，以非共價鍵的方式與蛋白結合。劉妍如等[16]運用分子對接技術模擬預測TCMSP數據庫中藥成分對SARS－CoV－2 3CL水解酶的作用，共篩選得到60個化合物，且所篩選化合物主要歸屬藥材為甘草、桑白皮、滿山紅、虎杖、車前草等。馬青云等[17]以3CL水解酶為靶蛋白，篩選出66個藥代動力學性質良好的天然小分子抑制劑，優選出12味中藥單味藥，2個中藥藥對及12個中藥處方作為抗CoV的候選方案。

本研究基于高通量虛擬篩選技術，對擬肽化合物庫進行了關于SARS－CoV－2 RdRp抑制劑的初步虛擬篩選，發現分子AR00455與RdRp潛在變構位點具有高度親和力，結合能為－11.101 kcal/mol，潛在抑制活性較強，并給出了AR00455分子與RdRp的結合模型。通過能量貢獻值分析發現，SARS－CoV－2 RdRp變構活性位點口袋中的A323，A319，A461，A460，A249，A396，A665，A350等關鍵氨基酸殘基對其與AR00455分子的相互作用力貢獻較大，這為后期基于此位點的擬肽小分子結構改造提供了方向和理論參考。

鑒于AR00455分子中各氨基酸殘基化學性質的差異，可對其進行以下修飾：一方面，肽鏈中Thr1和Asn6為極性不帶電氨基酸，可替換成同為極性不帶電氨基酸的Ser，Thr，Asn，Gln等；Lys2為帶正電氨基酸，可替換成Arg或His等帶正電氨基酸；Tyr3，Tyr4，Val8，Tyr9為非極性氨基酸，可替換成Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Tyr，Trp等非極性氨基酸。

另一方面，活性口袋處Asp170是極性帶負電氨基酸殘基，最靠近肽鏈Thr1片段，可考慮將Thr1替換成Arg，His，Lys等極性帶正電氨基酸；Tyr458是非極性氨基酸殘基，最靠近肽鏈Lys2片段，可考慮將Lys2替換成Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Tyr，Trp等非極性氨基酸；THR246，LEU247，LEU460，THR462等氨基酸殘基包圍著肽鏈片段Tyr3，可將Tyr3替換成Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Trp等非極性氨基酸或Ser，Thr，Asn，Gln等極性不帶電氨基酸；LEU460是非極性氨基酸殘基，最靠近Tyr4肽鏈片段，可將Tyr4替換成Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Trp等非極性氨基酸；Gly5－Asn6－Gly7肽鏈片段最靠近Tyr265非極性氨基酸殘基，可將Gly5－Asn6－Gly7肽鏈片段替換成由Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Tyr，Trp等組成；Thr324是極性不帶電氨基酸，最靠近Val8肽鏈片段，可將Val8替換成Ser，Thr，Asn，Gln等極性不帶電氨基酸；LEU389是非極性氨基酸，LYS391是極性帶正電氨基酸，二者都靠近Tyr9肽鏈片段，可將Thr9替換成Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Tyr，Trp等非極性氨基酸，或Arg和His等極性帶負電氨基酸。

AR00455分子是乳酸菌代謝產物中分離得到的一種細菌素，后續可多關注該類肽類化合物，以尋找新的有價值的活性小分子。鑒于虛擬篩選結果的局限性，后期還需通過體外和體內等活性試驗來驗證本研究結果，以期為擬肽類藥物的研發提供更為準確、可靠的試驗依據。