1例罕見ATR-X綜合征的基因突變分析

袁軍鴻， 段麗芬， 劉曉梅， 張云茜， 劉紅仙， 孫 浩， 褚嘉祐， 楊昭慶

ATR-X綜合征也稱X連鎖的α地中海貧血智力障礙綜合征(Alpha-thalassemia X-linked intellectual disability，ATR-X；OMIM：301040)，是由X染色體上的ATRX基因突變引起的罕見遺傳病[1]。ATR-X綜合征的致病基因位于Xq21.1，編碼了2492個氨基酸，所編碼的蛋白質是染色質重塑因子SNF2(SWI/SNF)家族成員，在體外具有一定的染色質重塑活性[2]。ATRX 基因包含約300 kb的基因組DNA，由35個外顯子組成[3,4]。ATR-X綜合征的臨床表現多為面部畸形、嚴重智力低下、輕度(或無)α-地中海貧血、生殖器不同程度的異常、骨骼異常和自閉癥行為[5]。該綜合征具有較廣的基因突變譜和臨床表型譜，但基因型與臨床表型的對應關系尚不清楚。本研究通過全外顯子組測序對一個核心家系中臨床表現為智力低下、異常面容伴陣發性抽搐的患者進行致病基因突變篩查，發現了ATRX基因上一個單堿基致病基因突變，現報道如下。

1 臨床資料

1.1 研究對象 獲取一個來自云南的家系(見圖1)，先證者為男性，6歲，漢族，以癲癇入院，行體格檢查、血液學常規及心電圖、腦電圖、心臟彩超、MRI及染色體核型分析等臨床檢測；父母為非近親婚配，無家族遺傳史，家系中其他成員未見相似異常表型。臨床為癲癇。

圖1 ATR-X綜合征家系圖。箭頭所示為先證者

1.2 臨床表型 先證者一般情況差，智力低下，發育落后，具有特殊面容如：眼距寬、鼻梁低平、小三角鼻、舌體大、嘴大、牙齒發育不良、耳位低、招風耳(見圖2)，患者手、腳骨骼未出現明顯異常，血液學常規檢測顯示血紅蛋白(Hb)為124.00 g/L，平均紅細胞體積(MCV)為88.00 fl，平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)為27.60 pg，未呈現α地貧異常指標。心臟檢查結果提示：(1)雙上腔靜脈、主動脈竇部增寬；(2)雙下肺靜脈共干；腦電圖顯示清醒期背景θ活動異常增多；頭部MRI檢查提示局部腦溝稍有加深；生殖器未見異常；染色體核型正常；頸部CT平掃未見異常征象。上述結果表明，患者呈現的臨床表型符合ATR-X綜合征的大部分典型臨床表型。該家系中其他人員的表型均未見異常。

圖2 患者面部特征。患者呈現特殊面容，包括眼距寬、鼻梁低平，小三角鼻、舌體大，嘴大，牙齒 發育不良、耳位低、招風耳

1.3 外周血全基因組DNA的提取及全外顯子組測序 根據知情同意原則，獲取該家系5名成員(Ⅱ、Ⅲ)抗凝外周靜脈血約2 ml，采用AxyPrepTMBlood Genomic DNA Miniprep Kit(Axygen，江蘇康寧生命科學有限公司)提取基因組 DNA。對先證者DNA進行全外顯子組測序，檢測到ATRX基因(NM_000489)第7外顯子中一個錯義堿基突變:c.A536G(p.N179S)。該突變位點的基因頻率在千人基因組數據庫，美國國家心肺和血液研究所外顯子測序計劃(esp6500siv2)，ExAC數據庫(Exome Aggregation Consortium)、gnomAD_exome數據庫(Genome Aggregation Database)中均為0，在美國國立衛生研究院臨床變異位點數據庫(NCBI CLINV AR)中顯示為致病突變。

1.4 Sanger測序檢測ARTX基因變異位點 對全外顯子組篩查所得的可疑候選基因突變位點采用Sanger DNA測序在家系成員中進行檢測，利用Geneious生物信息分析軟件(Biomatters Inc，美國)設計擴增ATRX基因片段的引物。正向引物序列(5’-3’)為 TTGCCAAGGTTGTCATGTGC，反向引物(5’-3’)為CCGGTGTGCTCCCATAATCA，擴增片段長度為494 bp。 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析和純化后進行Sanger DNA測序，測序結果采用Geneious軟件進行序列比對和分析。家系成員中基因突變位點的代表性Sanger測序結果(見圖3)。男性先證者為該突變位點的純合子(半合子)，其母親(Ⅱ1)和一個妹妹(Ⅲ3)是該突變位點的雜合子，為突變攜帶者；其父親(Ⅱ2)和另一個妹妹(Ⅲ2)的該位點為野生型，突變傳遞符合ATR-X綜合征以X連鎖模式遺傳的特征。

圖3 ATRX基因部分Sanger測序結果。先證者為ATXR NM_000489：c.A536G突變的純合子，其父親為野生型，其母親為該位點突變的雜合子

1.5 變異位點的蛋白結構分析 采用I-TASSER軟件(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)對包含突變位點在內的ATRX基因(NM_000489)第一外顯子至第九外顯子的氨基酸序列進行蛋白質結構和功能預測。通過I-TASSER軟件預測的ATXR蛋白質三級結構最優模型(見圖4)[6～8]。對野生型和突變型蛋白進行功能預測的結果發現：(1)在結合位點方面兩者的功能都與PDB數據庫中3qlaD蛋白模塊相似，都存在 ADD結構域；(2)在酶活性位點方面，野生型蛋白的功能與PDB數據庫中3eqlD功能相似，主要發揮轉移酶活性；而突變型蛋白的功能與PDB數據庫中1b0pA相似，主要發揮氧化還原酶功能，結果表明突變型與野生型蛋白質的功能可能有所不同。

圖4 ATRX(NP_000480.3)野生型和p.N179S突變型蛋白質三級結構預測。箭頭所指紅色部分為突變位點

1.6 ATRX基因c.A536G(p.N179S)突變的表型特征 本研究與國外文獻中報道c.A536G突變位點男性患者的主要臨床表型特征(見表1)。結果顯示攜該突變通常會導致患者出現面容畸形及不同程度的智力低下，呈現出共性特征。但同時該疾病的臨床表型也具有明顯的異質性，即相同基因突變在不同個體中呈現出不同的臨床表型。

表1 ATRX基因c.A536G的臨床表型

2 討 論

本文對1例臨床表現為智力低下伴有癲癇，具有特殊面容的患者進行了全外顯子組測序，結果在ATRX基因(NM_000489)第7外顯子上發現了一個堿基突變:c.A536G(p.N179S)。該突變位點在國外病例中已有報道，表明該突變位點為ATR-X綜合征的一個致病突變位點。本研究中患者具有ATRX綜合征典型的臨床特征，如智力低下、面容異常等，但該患者染色體核型正常，因此與一般的染色體疾病所致的智力低下有所區別。通過患者基因全外顯子測序及sanger測序檢測到該致病突變，并發現突變與表型的遺傳方式在該家系中呈現X-連鎖隱性遺傳病特征，由此確診為ATR-X綜合征患者。通過I-TASSER軟件分析該突變位點對蛋白結構和表達方面影響，發現該突變位點位于ATRX基因的ATRX-DNMT3-DNMT3L(ADD)鋅指結構域，其改變可能會引起ATRX-DNMT3-DNMT3L(ADD)鋅指結構域的空間結構發生改變，從而使某些酶活性位點發生改變。鋅指結構域已被證明在體外具有與DNA結合的活性，通過蛋白質印跡和免疫細胞化學分析均表明，在具有鋅指結構域突變的ATR-X綜合征患者中，ATRX蛋白的表達通常會發生改變或缺失[11]。ATRX蛋白在有絲分裂時與染色體的結合伴隨著蛋白質的磷酸化及其與異染色質蛋白1α(HP1α)的結合[12,13]。綜上，c.A536G突變患者所表現出的ATR-X綜合征推測可能是由于該突變導致了鋅指結構域的改變，從而影響了ATRX蛋白與染色質的結合以及后續基因的表達，進而導致疾病的發生。

ATR-X綜合征具有明顯的臨床異質性，其中遺傳異質性是一個主要原因，不同突變位點和突變性質可導致不同的臨床表型。臨床異質性還表現在具有相同基因突變的ATR-X綜合征患者之間仍然呈現出不同的表型，其原因可能是因為ATRX蛋白除了與異染色質的結合外，在有絲分裂中期也會與人類近端著絲粒染色體的短臂結合，而這些短臂上存在一些具有不同重復序列的核糖體DNA(rDNA)[14]，推測其可能導致相同的突變引起不同的病例效應，但相關的作用機制目前尚不清楚。之前對1例具有相同突變患者的研究發現了嚴重智力低下、異常面容、生殖器異常及骨骼異常的癥狀[9]，但本例中患者并未發現明顯的生殖器異常及骨骼異常(見表1)。除此之外，不同的突變位點產生的臨床表型也不一樣，ATR-X綜合征的突變區多發生在兩個較為保守的區域，即ADD區域和解旋酶區。發生在ADD區域的突變通常會導致較為嚴重的臨床表現，而發生在解旋酶區的突變所導致的臨床表型通常較前者輕。在同一突變區域內不同位點的突變也存在臨床異質性。如有文獻報道1例ATR-X綜合征患者在其ATRX基因第9外顯子存在c.736C>T (p.R246C)突變，且該位點的突變導致患者具有所有典型的ATR-X臨床表型，包括面容畸形、智力低下、α地中海貧血、生殖道異常、骨骼異常及流涎等[15]，而同樣處在該突變區域的本例研究中未發現α地中海貧血、生殖道異常等臨床表型。這些研究結果進一步展現出ATR-X綜合征具有明顯的臨床異質性。

除此之外，相同突變的來源可有不同，本研究患者遺傳自母親，但1例與本例研究具有相同位點突變的報道顯示發生在該例患者的ATRX基因c.A536G錯義突變為一新生(De Novo)突變[10]，對于X連鎖的新生突變發生的情況有多種，一種情況可能是發生在患者本身，而其母并不是攜帶者；也有可能是患者的母親的生殖細胞是嵌合體，其在有絲分裂過程中發生突變，但只是部分卵母細胞攜帶了突變的 X染色體。所以該研究也為遺傳咨詢和產前診斷提供更多的依據和線索。

本文通過全外顯子測序確定了1例罕見α地中海貧血X連鎖智力障礙綜合征患者家系中的基因突變，豐富了中國人中ATR-X綜合征的基因突變譜和臨床表型譜，為ATR-X綜合征臨床表型異質性和基因型的關系提供了更多的實驗證據，對該疾病的診斷、治療及遺傳咨詢提供了更多參考依據。但由于受患者和家系樣本數量的局限性，對于所發現致病突變關聯的表型異質性機制如ATRX基因與染色質的相互作用效應等還需要深入探討和研究，從而對罕見病防控和診療提供更多的理論線索和解決方案。