肌營養(yǎng)不良小鼠關(guān)鍵基因和通路的生物信息學(xué)分析

廖子鈺, 李 歡, 王 倞, 林金福, 張 成

杜興型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種X-連鎖隱性遺傳性疾病。DMD基因定位于Xp21.2，編碼具有抗?fàn)坷饔玫目辜∥s蛋白(dystrophin)[1]?；颊叱錾鬅o明顯癥狀，3～5歲時即出現(xiàn)行走、跑步異常，下蹲起立需扶膝，上樓困難，病程進展迅速，10歲左右不能行走，到20～30歲時死于心功能衰竭[2]。C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx)小鼠是DMD最常用的動物模型[3]。mdx鼠由于Dmd基因第23號外顯子無義突變，產(chǎn)生截短的、無功能的抗肌萎縮蛋白，導(dǎo)致肌肉收縮過程中肌膜容易受損，從而出現(xiàn)與人類患者相似的肌纖維壞死、細胞浸潤、再生等病理變化[4]。

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微陣列技術(shù)逐漸應(yīng)用于突變基因檢測和差異表達基因篩查[5～7]，對于研究許多疾病的發(fā)病原理、尋找生物標(biāo)記物和治療靶點有重要意義。

本研究從基因芯片公共數(shù)據(jù)庫GEO下載了3組mdx鼠基因表達數(shù)據(jù)，對在以上3個數(shù)據(jù)集中均為差異表達的基因進行基因本體論分析和富集信號通路分析，篩選出其中起核心作用的關(guān)鍵基因，對探索影響DMD發(fā)病的分子機制、尋找新的治療靶點具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 基因微陣列數(shù)據(jù)集的篩選 篩選條件：對照組為未作其他干預(yù)處理的C57BL/10野生型小鼠，實驗組為C57BL/10背景的mdx鼠，均為雄性，6～8周齡，取材部位為脛骨前肌或腓腸肌。以“Duchenne muscular dystrophy”和“mdx mouse”為檢索詞檢索GEO DataSets數(shù)據(jù)庫，獲得3個符合條件的數(shù)據(jù)集。

1.2 差異表達基因的獲取 在線工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)用于分析以上3組微陣列數(shù)據(jù)中mdx組小鼠和正常組的差異表達基因。篩選條件為：log2FC≥1或≤-1，即上調(diào)或下調(diào)的基因表達水平差異倍數(shù)(fold change,FC)≥2倍，以調(diào)整后P值<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。將各數(shù)據(jù)集得出的差異表達基因輸入venn diagram網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，綜合得出在3個數(shù)據(jù)集中均存在差異表達的基因。

1.3 差異表達基因本體論(Gene ontology,GO)和KEGG富集信號通路分析 GO分析從生物學(xué)過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個方面注釋基因功能。KEGG數(shù)據(jù)庫用于所富集信號通路分析，即差異表達基因位于某信號通路的基因數(shù)量。使用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對DEGs同時執(zhí)行GO和KEGG分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(proteins-protein interaction,PPI)與關(guān)鍵基因分析 使用在線網(wǎng)站STRING(https://string-db.org/,version 11.0)對DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，然后將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)輸入Cytoscape軟件進行可視化分析。PPI網(wǎng)絡(luò)中各DEG的相互作用關(guān)系用連接度(connective degree)表示，連接度高的基因是該網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點，稱關(guān)鍵基因。使用Cytoscape中的CytoHubba插件，根據(jù)MCC算法篩選前10位的基因作為關(guān)鍵基因。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達基因的篩選 納入的3個數(shù)據(jù)集為：GSE7187、GSE52766、GSE64418，均使用了基因微陣列技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。其中GSE7187篩選出648個DEGs；GSE52766篩選出365個DEGs；GSE64418篩選出285個DEGs。把3組DEGs輸入Venn diagram網(wǎng)站取交集，得出68個共同表達的DEGs(見圖1)。3個數(shù)據(jù)集的交集68個DEGs即為mdx鼠的特征性基因。各DEG在以上數(shù)據(jù)集的變化趨勢分別相同，其中61個基因上調(diào)，7個基因下調(diào)。

圖1 3個mdx鼠數(shù)據(jù)集的差異表達基因。使用venn diagram網(wǎng)站分析3個mdx鼠數(shù)據(jù)集中共同的差異表達基因的數(shù)量

2.2 差異表達基因的GO功能注釋分析及KEGG通路分析 通過DAVID網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)分析以上68個DEGs的功能與定位。GO分析的結(jié)果表明：(1)在生物過程(biological process,BP)方面，DEGs與免疫系統(tǒng)的過程、免疫反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)、中性粒細胞趨化性、ERK1和ERK2級聯(lián)陽性調(diào)控等相關(guān)；(2)在細胞組分(cellular component,CC)方面，DEGs主要存在于細胞膜、外泌體、細胞外區(qū)域；(3)在分子功能(molecular function,MF)方面，DEGs與蛋白質(zhì)結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、細胞因子激活、IgG結(jié)合等活動相關(guān)(P<0.05，見圖2)。KEGG分析結(jié)果表明DEGs主要富集于金黃色葡萄球菌感染、吞噬體、肺結(jié)核、哮喘、抗原處理和遞呈排斥等過程(P<0.05，見圖3)。

圖2 差異表達基因的Go功能注釋分析。綠色柱代表BP：生物學(xué)過程(biological process)，藍色柱代表CC：細胞組分(cellular component)，紅色柱代表MF：分子功能(molecular function)；縱軸代表富集基因數(shù)量

圖3 差異表達基因的KEGG通路分析。該氣泡圖依次展示了P值最小的前20個信號通路，其值越小，顯著程度越大?？v軸對應(yīng)功能或通路，橫軸對應(yīng)該通路中的差異基因和通路中所有基因的比值(以Enrichmen-score值表示)。氣泡顏色表示P值大??；氣泡大小表示該通路中差異基因的數(shù)目

2.3 DEGs蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)和模塊化分析確定關(guān)鍵候選基因 經(jīng)STRING v10網(wǎng)站構(gòu)建DEGs的蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)，得到的PPI由29個節(jié)點、157條互作邊構(gòu)成(見圖4)。選用Cytoscape的cytoHubba插件確定PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點，根據(jù)連接度由高到低篩選得到10個關(guān)鍵基因，依次為：Tyrobq、Emr1、C1qb、Ly86、C1qc、C1qa、Lyz2、Ms4a6d、Fcer1g和Fcgr3(見表1)。這些關(guān)鍵基因?qū)dx鼠的PPI網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性起重要作用。

表1 10個關(guān)鍵基因

圖4 可視化分析的PPI網(wǎng)絡(luò)。由29個節(jié)點、157條互作邊構(gòu)成。節(jié)點顏色表示該DEG變化趨勢，紅色為上調(diào)，藍色為下調(diào)；互作邊的寬度表示互作關(guān)系強度(即combined-score值)

3 討 論

盡管假肥大型肌營養(yǎng)不良癥是一種單基因遺傳疾病，但相同的基因突變類型可以導(dǎo)致顯著不同的臨床表現(xiàn)，如DMD基因外顯子3～7的缺失，有的患兒癥狀重為DMD，有的癥狀輕為BMD[8]?？赡艿脑驗樵摬∵M展過程涉及多個基因的差異表達，其表型是多信號通路共同起效的結(jié)果。迄今，一些具有單核苷酸多態(tài)性的修飾基因，如SPP1、LTBP4、CD40、ACTN3和THBS1，已被證明對假肥大型肌營養(yǎng)不良癥患者的表型產(chǎn)生影響[9]。因此，進一步探究發(fā)病過程中患者體內(nèi)基因表達譜的改變，篩選共同的差異表達基因，闡明核心調(diào)控基因和所在的信號通路，有助于提供新的治療靶點。

本研究基于公開數(shù)據(jù)庫進行基因表達分析，探究DMD疾病發(fā)生的分子機制。通過生物信息學(xué)方法篩選出DMD模型mdx鼠的關(guān)鍵基因，包括：Tyrobq、Emp1、C1qb、C1qc、Ly86、Lyz2、Fcer1g、Fcgr3和Ms4a6d。Tyrobp基因編碼的蛋白是許多細胞表面受體的信號適配器蛋白，在樹突狀細胞、破骨細胞、巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，在阿爾茲海默癥患者的大腦中顯著上調(diào)，具有重要調(diào)節(jié)作用。Tyrobp蛋白是一種免疫系統(tǒng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可與阿爾茨海默氏病(AD)相關(guān)免疫受體(TREM2、SIRPβ1、CR3)的胞外域形成復(fù)合物[10]，其作用主要為增強小膠質(zhì)細胞的吞噬活性，促進小膠質(zhì)細胞清除淀粉樣蛋白-β(Aβ)肽和凋亡的神經(jīng)元；此外，Tyrobp還通過抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的細胞因子的產(chǎn)生和分泌，參與抑制炎癥反應(yīng)[11]。降低TYROBP基因的表達可能通過調(diào)節(jié)免疫-炎癥反應(yīng)進而減緩甚至終止阿爾茲海默癥的進展[12]。

C1qA-C1qC-C1qB 3個基因等比例表達的18個亞基構(gòu)成人類補體蛋白C1q[13]。C1q結(jié)合包含IgG和IgM的免疫復(fù)合物并激活補體經(jīng)典途徑，負責(zé)清除免疫復(fù)合物和侵入病原體[14]；此外，在自身免疫病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中有預(yù)防作用[15]。DMD患者C1QB基因異常表達，與鈣離子大量內(nèi)流導(dǎo)致肌肉壞死有關(guān)[16]。

Emr1又稱Adgre1，屬于粘附G蛋白偶聯(lián)受體(ADGRE)的一個亞家族，該基因編碼的F4/80抗原是小鼠單核細胞-巨噬細胞標(biāo)記物[17]，在CD8+調(diào)節(jié)T細胞的產(chǎn)生中起重要作用[18]。Ly86基因編碼的蛋白是淋巴細胞抗原86，其在先天免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)的生理或病理調(diào)節(jié)中有重要作用[19]。小鼠溶菌酶2基因(Lyz2)在未成熟的巨噬細胞中中等表達，在成熟的巨噬細胞中高表達，參與宿主的免疫反應(yīng)[20]。小鼠免疫球蛋白G Fc結(jié)構(gòu)域受體基因(Fcer1g)則已被確認為大腦皮質(zhì)免疫模塊的關(guān)鍵基因，在β淀粉樣蛋白病理沉積轉(zhuǎn)基因小鼠的腦皮質(zhì)中發(fā)揮重要作用[21]。Fcgr3基因系靈長類FCGR2A基因的直系同源基因[22]，編碼自然殺傷細胞上的免疫球蛋白G Fc段受體(FcγR III)[23]。FcR-γ基因敲除小鼠缺乏抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，無法阻止體內(nèi)腫瘤的生長，這表明Fc受體依賴性機制促進了細胞毒性抗體針對腫瘤的免疫作用[24]。跨膜4結(jié)構(gòu)域亞家族A的成員6D基因(Ms4a6d)表達產(chǎn)物與巨噬細胞表面的免疫球蛋白超家族補體受體Vsig4相互作用形成表面抑制信號復(fù)合物(SISC)，造成小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)[25]。

本研究所得的10個關(guān)鍵基因主要是參加炎癥或者免疫反應(yīng)相關(guān)的基因。既往研究證明，炎癥反應(yīng)失調(diào)是DMD病理損害的重要機制[26]。DMD患者肌肉病理變化包括免疫學(xué)和炎性過程的異常、細胞自噬的缺陷和肌肉再生能力的喪失[27]。我們認為本研究的關(guān)鍵基因在DMD發(fā)病機制中亦是起調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)的作用。大部分關(guān)鍵基因在mdx鼠中呈上調(diào)表達，只有Emr1基因呈下調(diào)表達，可能原因為：一方面，各基因?qū)ρ装Y反應(yīng)促進或抑制作用的共同效應(yīng)導(dǎo)致了DMD的病理學(xué)改變趨向炎癥反應(yīng)增強；另一方面，DMD致病機制涉及的免疫反應(yīng)途徑具有一定特異性。

目前，針對DMD免疫機制的治療如皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、免疫靶向藥物等均能在一定程度上改善癥狀、延緩疾病進程[28]。本研究的所提出的差異表達基因和關(guān)鍵基因或能成為DMD免疫調(diào)節(jié)的特異性靶點，促進DMD免疫治療的發(fā)展。這些關(guān)鍵基因在杜興型肌營養(yǎng)不良癥發(fā)病機制中的作用以及作為生物標(biāo)志物的有效性，還需要進一步實驗驗證。

4 結(jié) 論

本研究通過對3個mdx鼠數(shù)據(jù)集進行全面的生物信息學(xué)分析，提示炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)相關(guān)分子機制在DMD的發(fā)病過程中起重要作用。篩選出的Tyrobq、Emr1、C1qb、Ly86、C1qc、C1qa、Lyz2、Ms4a6d、Fcer1g和Fcgr3等10個關(guān)鍵基因提示了DMD新的治療靶點。