Ox-LDL刺激人外周血單個核細胞來源巨噬細胞RvD2的合成

唐 欣， 王修哲， 趙玉武

脂質代謝失衡和動脈壁中富含膽固醇結晶的巨噬細胞聚集是動脈粥樣硬化斑塊的重要病理過程，動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病[1]。動脈粥樣硬化斑塊引起的血管狹窄，或者由于斑塊不穩定導致斑塊脫落，會導致急性缺血性腦卒中的發生[2]。因此，動脈粥樣硬化的發生發展機制研究對于腦梗死的預防具有十分重大的意義。

特化促消退介質(specialized pro-resolving mediators,SPMs)，是一類小分子脂質物質，在體內發揮促進炎癥消退、組織修復、血管再生等功能[3]。消退素D2(RvD2)是由5-LOX和15-LOX催化DHA所合成的一種SPM，與其受體GPR18結合后激活信號通路，發揮生物學作用[4]。研究發現，RvD2對動脈粥樣硬化斑塊[5]和腦梗死動物模型均具有保護作用[6]。但是，目前氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)對腦梗死患者巨噬細胞RvD2代謝的作用尚不明確。

本研究利用ox-LDL刺激腦梗死患者的巨噬細胞，與健康對照組比較，觀察RvD2的合成代謝情況并探索其機制，為進一步探索RvD2在動脈粥樣硬化斑塊型腦梗死中的作用及機制提供依據。

三十三天為額爾和木·哈日求情之后，又給他出謀劃策，告訴他如何戰勝哈冉惠，而哈冉惠放過額爾和木·哈日之后，說出了這樣的話：

1 材料與方法

1.1 研究人群和人群數據 從上海交通大學附屬第六人民醫院神經內科住院患者中選取急性缺血性腦卒中患者12例，并選取5例無神經系統疾患的健康志愿者(對照組)。所有入組的患者或志愿者入選前一個月內均無急性系統性炎癥，并嚴格排除包括昏迷、嚴重心臟、肝腎功能不全、精神疾病、其他內分泌疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、纖溶性溶栓等情況。所有急性缺血性腦卒中患者均以《中國急性缺血性腦卒中診療指南2014年》作為診斷標準，通過計算機斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)確診。本研究已獲得上海交通大學附屬第六人民醫院倫理委員會批準。所有參與者均簽署知情同意書。本研究收錄包括年齡、性別、吸煙、飲酒史、高危病史(高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、房顫)等基本資料，并采集糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹血糖(FBG)、總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、白細胞計數(WBC)、中性粒細胞計數等常規生化檢查數據。

1.2 主要試劑及儀器 RIPA裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒(BCA Protein Quantitation Kit，中國)、和超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物科技有限公司，中國)，蛋白酶抑制劑(Roche)。RvD2 ELISA 試劑盒，5-LOX 多克隆抗體(Cayman Chemical Company，美國)；GPR18單克隆抗體，15-lox多克隆抗體(abcam，美國)；1640培養基，胎牛血清(FBS)(hyclone,美國)；Ficoll淋巴細胞分離液(GE health，美國)；ox-LDL(thermofisher，美國)；M-CSF(Peprotech);凝膠成像系統、多功能酶標儀和Western blot設備(Bio-Rad，美國)；熒光定量PCR儀(Prism 7500，美國)。

1.3 巨噬細胞培養和細胞實驗分組 抽取人外周血約10 ml，用PBS稀釋后加入Ficoll分離液,以600 g，20 min離心分離外周血單個核細胞(PBMC)。1640培養基重懸PBMC后，加入培養板中，待1 h后細胞貼壁，棄去上清，加入新鮮的含10% FBS以及M-CSF(50 ng·ml-1)的1640完全培養基，每2～3 d換液，培養6～7 d后，細胞即分化為成熟的巨噬細胞。將每個健康對照及腦梗死患者的巨噬細胞隨機分為空白對照組，ox-LDL(10 μg·ml-1)刺激組，培養24 h后，分別收集細胞培養上清及蛋白。

2.3 ox-LDL對巨噬細胞中RvD2合成酶及受體表達的影響 利用Western blot法檢測蛋白表達水平，比較巨噬細胞在ox-LDL刺激前后，RvD2合成關鍵酶5-LOX、15-LOX及其受體GPR18的表達水平。結果表明，15-LOX在ox-LDL刺激后，表達顯著升高(P<0.05)，而5-LOX的表達量在刺激前后無明顯差異。另一方面，RvD2受體GPR18的表達在ox-LDL刺激后也升高了(P<0.05)(見圖2)。

如圖2所示，觸發脈沖編號表示觸發的換流閥編號。在一個周期內，換流閥以鎖相環過零點時刻所對應的電角度為基礎滯后觸發指令角α，每隔60°發出觸發脈沖信號，由于不對稱情況下鎖相環無法跟蹤實際的同步初相位，產生觸發脈沖時換流閥兩極電壓可能為負，換流閥滯后導通。以ca換相為例，詳細分析換流閥延遲導通及關斷的情況，vca和分別表示鎖相環輸出的同步電壓和實際換相線電壓，σca為不對稱情況下滯后于vca的電角度，φab0、φbc0、φca0為各換相線電壓過零時刻對應的電角度。

中國始終奉行獨立自主的和平外交政策、防御性國防政策和積極防御軍事戰略，無論國防費投入多少，國防和軍隊現代化發展到什么程度，都永遠不稱霸、永遠不擴張、永遠不搞軍備競賽，也永遠不對任何國家構成威脅。中國軍事力量是履行新時代使命任務的堅定力量，是維護地區與世界和平穩定的強大正能量。

2.1 臨床基線資料比較 腦梗死組與健康對照組在年齡、性別、抽煙、飲酒史以及高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、房顫、糖尿病等高危因素中，均無統計學差異(見表1)。生化實驗室檢查，包括糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹血糖、總甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)、白細胞計數、中性粒細胞計數等在腦梗死組與健康對照組間均不存在統計學差異(見表2)。

1.4.2 Western blot 免疫印跡法 配制SDS-PAGE凝膠，向加樣孔內加入10 μl蛋白樣品，60V電泳40 min，再120 V 電泳1.5 h 左右，將不同分子量的蛋白分離。用甲醇浸泡活化PVDF膜，300 mA 轉膜100 min。再用加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用β-actin(1∶3000)、15-LOX(1∶1000)、5-LOX(1∶1000)和GPR18(1∶1000)稀釋后覆蓋膜，4 ℃搖床孵育過夜，第2天用TBST洗膜10 min，× 3 次，加入辣根過氧化物酶偶聯的相對應的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，TBST 洗膜10 min，× 3 次。最后，用Super Signal ECL熒光顯示劑顯影，凝膠成像儀拍攝，Image J 軟件定量分析蛋白表達高低。

1.5 油紅染色檢測巨噬細胞泡沫化程度 將24孔板中細胞培養基去掉，PBS洗3遍，向細胞加入4%PFA室溫固定20 min，再用PBS洗3遍，加入60%異丙醇浸洗5 min，棄去60%異丙醇后加入新配制好的0.5%油紅染液(ORO)，60 ℃浸染10 min。棄去染色液，再加60%異丙醇分化1 min，棄去異丙醇，PBS洗2～5次，直到無多余染液。將爬有細胞的蓋玻片取出，置于載玻片上，用甘油封片，顯微鏡下拍照。

1.4 Western blot 免疫印跡法檢測蛋白表達

2.2 ox-LDL對巨噬細胞RvD2合成代謝的影響 RvD2 ELISA結果表明，與空白對照相比，即ox-LDL刺激前,巨噬細胞經ox-LDL刺激24 h后，細胞培養上清中RvD2的濃度顯著升高(P<0.001)(見圖1)。

在懸浮控制器內部控制電路中，主要控制信號采用冗余設計。間隙信號采用 3 路并行信號處理和濾波電路，加速度信號采用 2 路并行信號處理和濾波電路，電流信號采用 2 路并行信號處理和濾波電路。當其中的1路信號發生故障或錯誤時，不會影響其它電路。采用冗余和容錯處理后，提高了系統的可靠性，使系統的可靠性指標得到很大改善。

2 結 果

1.4.1 蛋白樣品制備 細胞分別經ox-LDL處理及空白處理24 h，每孔加入PBS 1 ml 洗3 次，用細胞刮收取各組細胞至1.5 ml 離心管中，4 ℃，400 g離心5 min后，去掉上清，加入蛋白裂解液100 μl，冰上裂解15 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min，留取上清，即為蛋白樣品。各蛋白樣本均進行BCA 法蛋白定量檢測，根據標準曲線計算出各蛋白樣品濃度，并將其統一稀釋至2 μg·μl-1。向蛋白樣品中加入上樣緩沖液后，金屬浴加熱5 min，促使蛋白充分變性。

表1 腦梗死患者組與非腦梗死健康對照組患者基本特征

表2 腦梗死患者組與非腦梗死健康對照組實驗室檢查

1.6 酶聯免疫吸附法檢測RvD2水平 將收集好的細胞培養上清暫時保存于-80 ℃，待所有樣本收集完整。本實驗嚴格按照廠家說明書操作。簡單來說，將細胞培養上清從冰箱取出，避免反復凍融。將RvD2 標準品梯度稀釋，制備成不同濃度的標準品后，將標準品和樣品分別加入對應孔中。再加入各反應試劑，4 ℃孵育18 h。第2天，洗板后，加入反應液孵育90～120 min，讀取OD值，根據標準曲線計算出每個樣本的RvD2濃度。

注：與control組比，ox-LDL刺激組，巨噬細胞合成RvD2增多***P<0.001

2016年，丹麥環境和食品部部長曾強烈要求歐盟委員會在歐洲范圍內禁止塑料微珠用于化妝品中[11]。他認為，必須限制塑料微珠的適用范圍以確保其最終不存在于水生環境和食物鏈中。丹麥環境部稱，來源于化妝品并排放到水生環境的塑料微珠全國占0.1%，這些直徑微小的顆粒可能會流入污水處理廠，繼而流入歐洲水域。還認為在化妝品中不需要使用塑料微粒，尤其是存在可用替代物質（如可生物降解的杏仁）的情況下。

注：A： 5-LOX、15-LOX、GPRR18在control與ox-LDL刺激組間的Western blot 結果；B～D：與control組比，ox-LDL刺激組，巨噬細胞15-LOX及GPR18表達上調，5-LOX表達無差異*P<0.05

2.4 腦梗死患者巨噬細胞合成RvD2的功能異常 RvD2的 ELISA結果表明，將ox-LDL刺激后分泌的RvD2與空白對照組做差值分析，腦梗死組的巨噬細胞分泌的RvD2增高的絕對值較健康對照組低(P<0.05)(見圖3)。

注：腦梗死組RvD2升高的絕對值較健康對照組低*P<0.05；H：健康對照組；CI：腦梗死組

2.5 巨噬細胞泡沫化的程度 油紅染色顯示巨噬細胞泡沫化程度。染色結果顯示，在ox-LDL刺激后，無論健康對照組或腦梗死組，含紅色脂滴的巨噬細胞均明顯增多。此外，腦梗死組相對于健康對照組紅色脂滴更多，泡沫化程度更嚴重(見圖4)。

注：與control組相比，ox-LDL組紅色空泡性脂滴明顯增多;而腦梗死組與健康對照組相比，巨噬細胞胞體內紅色脂滴更多。H：健康對照組；CI：腦梗死組

3 討 論

大量研究發現，炎癥反應是動脈粥樣硬化斑塊的發生發展一個重要機制。本研究從炎癥消退的角度，發現了腦梗死患者的巨噬細胞在ox-LDL誘導的炎癥反應模型中，RvD2合成障礙。

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研究發現，血液循環中過多的ox-LDL可造成巨噬細胞氧化應激損傷，發生炎癥反應，釋放如IL-1等炎癥因子，導致巨噬細胞泡沫化，形成粥樣硬化斑塊[1，7]。巨噬細胞是機體產生RvD2的主要細胞之一[8]，生成的RvD2也可以與巨噬細胞受體結合，促使巨噬細胞向Ly6Clow的抗炎亞型轉化，促進炎癥消退。Ly6Clow的巨噬細胞能夠產生更多RvD2，這可能是機體在炎癥反應過程中的一種主動的保護性反應[9]。RvD2還能夠提高人巨噬細胞對凋亡壞死細胞的吞噬清除能力[10]。RvD2能夠抑制巨噬細胞炎癥因子的釋放誘導巨噬細胞向抗炎亞型M2轉化[11]。巨噬細胞產生的RvD2還能促進血管內皮細胞的遷移、減少中性粒細胞浸潤等，從而保護血管[12]。在本研究中，ox-LDL刺激巨噬細胞24 h后，RvD2的合成水平升高了，這可能是巨噬細胞的主動保護性反應。生成的RvD2可以促進巨噬細胞向抗炎亞型M2轉化，增強巨噬細胞的吞噬功能，以提高對ox-LDL的處理轉化能力，減輕脂質超載以及巨噬細胞泡沫化，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。此外，ox-LDL刺激引起巨噬細胞15-LOX表達上調，促進RvD2的合成，這與其他炎癥相關性研究中結果的相一致[13]。本研究還發現，ox-LDL刺激后，巨噬細胞GPR18表達上調。GPR18是RvD2的特異性受體，在RvD2增強巨噬細胞吞噬功能[14]及促進巨噬細胞類型轉化的過程當中也是必不可少的[15]。這些結果提示，ox-LDL刺激巨噬細胞合成RvD2，是一種巨噬細胞自身的主動保護性反應。但是，本研究發現，腦梗死患者巨噬細胞在ox-LDL刺激后產生RvD2濃度的絕對值，比健康對照組的巨噬細胞低，并且相對應的，腦梗死組患者巨噬細胞泡沫化程度也更嚴重。這提示我們，腦梗死患者的巨噬細胞對ox-LDL后刺激保護性合成RvD2的能力存在缺陷。這可能是腦梗死患者動脈粥樣硬化斑塊不穩定和過度的炎癥反應的重要原因之一。

總的來說，本研究發現，ox-LDL促進巨噬細胞保護性合成RvD2增多，可能是通過提高15-LOX的表達水平來促進的RvD2合成。此外，ox-LDL刺激后，腦梗死患者的巨噬細胞合成RvD2的能力是下降的，提示腦梗死患者巨噬細胞的促炎癥消退功能可能存在缺陷，這可能是動脈粥樣硬化斑塊和腦梗死發生發展的重要機制之一。但是，外源性給予RvD2治療是否能夠通過調控巨噬細胞炎癥消退功能，從而對動脈粥樣硬化斑塊或腦梗死產生保護作用仍有待進一步的研究。