羅紅霉素對中性粒細胞哮喘大鼠氣道炎癥、氣道重塑和鈣結合蛋白S100A9表達的影響

陳慧君，顧曉菲，田江華，戴元榮，涂軍偉

中性粒細胞在哮喘的發生和發展中起到重要作用，中性粒細胞性哮喘患者具有痰液中性粒細胞數目增多、易感染病毒、有較長的吸煙史和對糖皮質激素抵抗等特點[1-2]。S100A9是鈣結合蛋白S100家族中重要的一個成員，具備細胞調節活性，參與花生四烯酸、骨髓細胞成熟及細胞遷移等病理過程，在免疫炎癥性疾病、腫瘤和疼痛等疾病的發生和發展中起到重要作用[3]。S100A9在中性粒細胞哮喘中的作用尚不清楚，哮喘患者痰液的蛋白質組學分析顯示S100A9蛋白表達水平明顯升高[4-5]。羅紅霉素屬于新一代大環內酯類抗生素，對哮喘的治療有一定價值，但是其作用機制目前尚未完全明確[6]。本研究旨在探討S100A9在中性粒細胞哮喘中的作用及羅紅霉素可能的干預機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 18只6～8周健康雄性SPF級Brown Norway（BN）大鼠，體質量150～180 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2017-0022，飼養于溫州醫科大學實驗動物中心。所有大鼠均自由進食和進水，12 h/12 h晝夜明暗交替照明。適應性喂養1周后，將大鼠分為對照組、模型組和羅紅霉素組，每組6只。動物操作嚴格遵循美國國立衛生院頒發的《醫學實驗動物使用及關愛指南》。試劑和儀器：卵清白蛋白（OVA）和弗式完全佐劑（FCA）購于美國Sigma公司，羅紅霉素購自美國MCE公司，苯巴比妥購于天津阿爾塔科技有限公司，瑞氏-吉姆薩染色試劑盒購于上海歌凡生物科技有限公司，多聚甲醛購于浙江聯碩生物科技有限公司，S100A9、IL-17和IL-25酶聯免疫吸附試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司。BLD-200Z攝像型三目倒置生物顯微鏡購于北京世紀科信科學儀器有限公司，HBS-1096C型酶標儀購自南京德鐵實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立和藥物干預 參考Dejager等[7]研究建立中性粒細胞哮喘模型。模型組和羅紅霉素組大鼠造模第1天、第8天時腹腔注射乳化（抗原乳化方法）于0.5 ml FCA的含10%OVA的0.9%氯化鈉注射液5 ml。第15天時，將上述兩組大鼠放置于霧化箱中，給予8周的1%OVA霧化吸入（隔天吸入1次，每次30 min），激發哮喘。羅紅霉素組大鼠在每次激發前30 min，給予羅紅霉素灌胃，劑量為30 mg/kg；而對照組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.2.2 標本采集 末次氣道激發24 h后，腹腔注射苯巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，從腹主動脈采血3 ml，2 500 r/min離心15 min，留取上層血清。將大鼠左側支氣管進行結扎，用無菌0.9%氯化鈉注射液進行左肺支氣管肺泡灌洗，收集灌洗液，1 500 r/min離心10 min，留存上清液，灌洗液離心后的沉渣用于細胞計數。取大鼠右肺上葉組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進行連續切片，厚度為4 m。

1.3 檢測指標（1）哮喘評分：0分：活動靈活，沒有出現呼吸急促；0.5分：呼吸急促但并未伴腹式呼吸；1分：呼吸困難；2分：呼吸困難并伴有咳嗽；3分：深入呼吸、張口呼吸、口耳鼻發紺；4分：休克死亡[8]。（2）肺泡灌洗液中細胞計數：肺泡灌洗液1500 r/min離心10 min，沉淀細胞經處理后取細胞懸液，經瑞氏-吉姆薩染色后顯微鏡下進行細胞分類計數，包括中性粒細胞計數、嗜酸性粒細胞計數、淋巴細胞計數和單核細胞計數。每張切片在顯微鏡400倍視野下進行觀察，取5個視野，每視野分類計數200個細胞，計算炎癥細胞所占比例。（3）支氣管肺組織病理學觀察：將石蠟切片脫蠟至水，隨后進行蘇木素染色和伊紅染色（HE染色），最后脫水封片。用顯微鏡觀察大鼠肺組織病理形態學變化。顯微鏡下放大200倍，選取20個完整的支氣管橫斷面，用Image-Pro Plus 6.0軟件測量基底膜周徑（Pbm）、支氣管總管壁面積（WAt）、氣道內壁面積（WAi）及平滑肌面積（WAm），為消除管徑、氣道狀態和切片方向等造成的誤差，用Pbm將上述測量值標準化。以總管壁厚度（WAt/Pbm）、內壁厚度（Wai/Pbm）和平滑肌厚度（WAm/Pbm）判斷氣道重塑程度[9]。（4）酶聯免疫吸附試驗檢測血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25水平：嚴格按照試劑盒說明書進行操作，檢測S100A9、IL-17和IL-25水平，酶標儀波長設置為450 nm。（5）免疫組織化學染色法檢測大鼠肺組織S100A9蛋白表達：經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、枸櫞酸溶液抗原修復后，聚乙二醇辛基苯基醚通透，用3%過氧化氫溶液滅活內源性過氧化物酶，隨后用山羊血清封閉。滴加S100A9一抗（1∶500），孵育過夜。用DAB顯色，蘇木精復染。梯度酒精脫水，二甲苯溶液透明，中性樹膠封片。顯微鏡下進行觀察，棕黃色為表達陽性。用Image Pro Plus 6.0軟件分析平均光密度。

1.4 統計方法 采用SPSS20.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況 對照組大鼠精神狀態良好，毛色正常，呼吸均勻。模型組大鼠首次激發后，表現出呼吸急促、呼吸節律不規則及煩躁不安；多次激發后呼吸癥狀加重，體質量稍下降，毛色不光澤。羅紅霉素組大鼠呼吸癥狀較模型組減輕。對照組和羅紅霉素組哮喘評分分別為（0.34±0.12）分和（1.25±0.08）分，均低于模型組的（3.02±0.99）分（F=20.001，P＜0.05）。

2.2 各組肺泡灌洗液中細胞計數比較與模型組比較，對照組中性粒細胞計數和嗜酸性粒細胞計數明顯增高（均P＜0.05），而淋巴細胞計數和單核細胞計數明顯下降（均P＜0.05）。與模型組比較，羅紅霉素組中性粒細胞計數和嗜酸性粒細胞計數明顯降低（均P＜0.05），而淋巴細胞計數和單核細胞計數明顯增高（均P＜0.05）。見表1。

表1 各組肺泡灌洗液中細胞計數比較 %

2.3 病理學觀察 對照組大鼠支氣管壁完整，管腔規則，基地膜較薄，未見炎癥性改變。模型組大鼠支氣管、肺間質、肺泡腔中有大量炎細胞浸潤，支氣管皺襞較多，并且氣管壁增厚，管腔變窄（封二彩圖3），鏡下可見黏膜上皮細胞的脫落和壞死；羅紅霉素組大鼠的病理表現較模型組輕。與對照組比較，模型組WAt/Pbm、Wai/Pbm和WAm/Pbm明顯增高（均P＜0.05）；與模型組比較，上述指標明顯降低（均P＜0.05）。見表2。

2.4 血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25的表達水平 與對照組比較，模型組血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25表達水平較高（均P＜0.05）；與模型組比較，羅紅霉素組上述指標表達水平較低（均P＜0.05），見表3。血清中S100A9分別與IL-17、IL-25呈正相關（r=0.797、0.493，均P＜0.05）；肺泡灌洗液中S100A9也分別與IL-17、IL-25呈正相關（r=0.858、0.708，均P＜0.05）。

表3 血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25的表達水平 ng/L

2.5 肺組織S100A9的表達 免疫組織化學染色顯示S100A9表達于上皮細胞、平滑肌細胞、粒細胞胞質，陽性表達呈棕黃色（封二彩圖4）。模型組S100A9平均光密度值為（0.27±0.09），高于對照組的（0.02±0.05）（P＜0.05），羅紅霉素組 S100A9平均光密度值為（0.09±0.02），低于模型組（P＜0.05）。

3 討論

中性粒細胞哮喘的發病機制尚未完全明確，可能涉及免疫炎癥損傷、氣道高反應性和氣道重塑[10]。因此，闡明中性粒細胞性哮喘的發病機制具有重要意義。S100家族包含20多個成員，S100A9定位于人染色體q21上，具有抑制酪氨酸激酶活性[3]。S100A9能夠誘導中性粒細胞的趨化和黏附，在腫瘤、心血管疾病、風濕性疾病及感染性疾病中起到重要作用[4,11-13]。周四芳等[14]發現，誘導痰中性粒細胞S100A8/A9表達水平與兒童哮喘的病情嚴重程度和布地奈德治療效果有關。以上提示S100A9可能在中性粒細胞哮喘中發揮重要作用。本研究模型組中性粒細胞計數、氣道重塑指標和炎癥指標明顯增高。與對照組比較，模型組大鼠血清和肺泡灌洗液中S100A9均較高，這提示S100A9可能參與了中性粒細胞哮喘的發生。Kim等[15]研究發現，S100A9可以通過促進支氣管上皮細胞因子分泌，抑制中性粒細胞凋亡，進而參與哮喘進展。氣道重塑是哮喘重要的病理變化，本研究以WAt/Pbm、Wai/Pbm和WAm/Pbm來判斷氣道重塑程度，模型組上述指標明顯增高，與文獻[16]報道一致。IL-17和IL-25在中性粒哮喘中起到重要作用，與氣道重塑和哮喘嚴重程度密切相關[17-18]。本研究發現血清和肺泡灌洗液中血清中S100A9分別與IL-17和IL-25呈正相關，這說明S100A9可能參與了中性粒細胞哮喘的氣道重塑。

本課題組前期發現羅紅霉素可以通過抑制微囊蛋白-1和磷酸化p42/p44原蛋白激活蛋白激酶，抑制哮喘大鼠的氣道重塑[19]；另外，還能抑制哮喘大鼠的氣道平滑肌增殖[6]。微囊蛋白-1和磷酸化p42/p44原蛋白激活蛋白激酶可能影響了S100A9的活性[6]。筆者推測羅紅霉素可能是通過S100A9而發揮作用。本研究結果顯示與模型組比較，羅紅霉素組S100A9、IL-17和IL-25表達水平明顯下降，血清和肺泡灌洗液中S100A9分別與IL-17和IL-25呈正相關。這提示羅紅霉素可能通過S100A9發揮抗炎和調節氣道重塑作用。

綜上所述，本研究證實S100A9在中性粒細胞哮喘的氣道炎癥和氣道重塑中可能起到重要作用，羅紅霉素可能通過抑制S100A9表達發揮治療哮喘的作用。未來需要進一步分析S100A9的具體生物學機制，開展臨床實驗，分析S100A9在中性粒細胞哮喘診斷和治療中的作用。