抗精神病藥喹硫平對少突膠質細胞周期的影響及其作用機制研究*

王斕，陳浙麗，徐亮，徐小明，王軼虎

（湖州市第三人民醫院 老年精神科，浙江 湖州313000）

1 材料與方法

1.1 細胞及實驗動物

1.1.1 少突膠質細胞的來源及培養少突膠質細胞從新生的Sprague-Dawley 大鼠大腦皮層組織中制備[9]，其原代培養是基于McCarthy 技術[10]。實驗前，將OPCs 接種于增殖培養基中培養48 h。增殖培養基為DMEM/F12，并添加2%B27、0.5%胎牛血清、L-谷氨酰胺、抗生素、血小板源性生長因子（plateletderived growth factor, PDGF）10 ng/ml 和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）10 ng/ml。

1.1.2 實驗動物雄性CD-1 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0013]，12 h 晝/夜循環照明。12 只小鼠隨機分為對照組和喹硫平組，每組6 只。分別給予生理鹽水和富馬酸喹硫平10 mg/（kg·d）鹽水溶解后腹腔注射30 d。最后一次注射12 h 后處死小鼠，解剖前額皮質進行基因表達分析。

1.2 主要儀器、試劑及藥物

1.2.1 主要儀器流式細胞儀（美國Becton Dickinson 公司），ViiA 7 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）系統（美國應用生物系統公司）。

1.2.2 主要試劑與藥物B27（美國Thermo Fisher Scientific 公司），PDGF 和bFGF（美國Protech 公司），大鼠單克隆anti-溴脫氧尿苷（Bromodeoxyuridine,BrdU）和p21（英國Abcam 公司），兔多克隆anti-Ki67和p21 shRNA 質粒（美國Santa Cruz 公司），1% N2 和β-actin（英國Sigma 公司），Trizol 試劑（美國Invitrogen公司），Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司）。富馬酸喹硫平（英國AstraZeneca UK Limited 公司，批準文號：H20160665，規格：0.2g×20 片）

1.3 細胞周期檢測

將OPCs 細胞按5×105個細胞/孔接種于聚-賴氨酸包覆的6 孔板中。在增殖培養基中培養48 h，用堿性培養基（含2%B27 的DMEM/F12 培養基）替代培養，并用喹硫平（1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）處理48 h。為檢測喹硫平對PDGF 誘導的細胞周期激活的影響，增殖培養基培養48 h 后，用基礎培養基替代培養基，并加入PDGF（10 ng/ml）、喹硫平（10 μmol/L）或兩者的混合物培養48 h。將OPCs 細胞分為對照組（培養48 h）、PDGF 組（加入PDGF 10 ng/ml 培養48 h）、喹硫平組（加入喹硫平10 μmol/L培養48 h）和PDGF+喹硫平組（加入PDGF 10 ng/ml和喹硫平10 μmol/L，培養48 h）。OPCs 用0.25%胰蛋白酶消化，70%乙醇固定，采用流式細胞術測定細胞周期中G0/G1、S、G2 期細胞百分比[11]，使用Cell Quest Pro 軟件對數據進行分析。

1.4 細胞周期退出指數測定

OPCs 細胞可以在細胞周期中繼續循環自我更新，也可以退出細胞周期進行分化。細胞周期退出是少突膠質細胞分化的前提條件，因此本實驗檢測喹硫平和PDGF 對細胞周期退出的影響。細胞周期分為靜息期（G0）、準備期（G1）、DNA 復制期（S）、S 和M 期之間的間隙（G2）和細胞分裂期（M）。采用BrdU 抗體標記處于S 期的細胞，使用Ki-67 抗體標記除G0 期外整個細胞周期的增殖細胞，計算細胞周期退出指數。BrdU+/Ki-67+雙標記細胞表示細胞周期內的細胞比例，BrdU+/Ki-67 細胞表示細胞周期外的細胞比例。細胞周期退出指數以BrdU+/Ki-67-細胞數除以BrdU+細胞總數表示[12]。將OPCs細胞接種在24 孔板上，增殖培養48 h。用基礎培養基（含2% B27 的DMEM/F12 培養基）替代培養，加入PDGF 10 ng/ml、喹硫平10 μmol/L 或兩者的混合物培養24 h，并分為對照組（培養24 h）、PDGF 組（加入PDGF 10 ng/ml 培養24 h）、喹硫平組（加入喹硫平10 μmol/L 培養24 h）和PDGF+喹硫平組（加入PDGF 10 ng/ml 和喹硫平10 μmol/L 培養24 h）。固定OPCs細胞，細胞核DNA 變性后，用大鼠單克隆anti-BrdU（1∶100）和兔多克隆anti-Ki67 一級抗體（1∶100）孵育，用結合熒光染料的二級抗體進行免疫細胞化學檢測。

1.5 細胞分化分析

將OPCs 細胞按2.5×104個細胞/孔接種于24 孔板中，增殖培養48 h。將增殖培養基替換為分化培養基，并在培養基中加入喹硫平后持續培養3 d。將OPCs 細胞分為對照組（培養3 d）、喹硫平10 μmol/L組（加入喹硫平10 μ mol/L 培養3 d）和喹硫平20 μmol/L 組（加入喹硫平20 μmol/L 培養3 d）。少突膠質細胞分化培養基為DMEM/F12，并添加1%N2、L-谷氨酰胺、0.5%胎牛血清、抗生素、三碘甲狀腺氨酸9.8 g/L、生物素10 g/L 和轉鐵蛋白25 g/L。使用抗體髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein, MBP）（成熟少突膠質細胞的標志）對細胞培養物進行免疫細胞化學檢測。使用激光掃描共聚焦顯微鏡獲取圖像，Image-Pro Plus 軟件進行分析。在分化培養基中加入喹硫平后3 d 和4 d，采用少突膠質細胞標志物MBP 固定并標記少突膠質細胞，根據形態復雜性將MBP 陽性細胞分為低分化和高分化。

1.6 qRT-PCR

小鼠前額皮質區域表現出最明顯的髓鞘特異性基因表達變化。為研究喹硫平對細胞周期的調控機制，本研究測定喹硫平干預（10 mg/kg，1 次/d）小鼠30 d 后，小鼠前額皮質中8 個細胞周期相關mRNA 相對表達量。其中包括細胞周期蛋白D1（Ccnd1）、細胞周期依賴激酶2（CDK2）、CDK4、轉錄因子2（E2F2）和視網膜母細胞瘤蛋白1（Rb1），其可正向調節細胞周期G1/S、G2/M 轉變、DNA 合成和有絲分裂。另外檢測環獨立激酶抑制劑p21 和p27 的相對表達量，以及p21 的上游介質轉錄因子p53 的相對表達量。按照Trizol 試劑盒說明書進行操作提取總RNA。利用SuperScriptTMⅢ逆轉錄酶將總RNA 1.5 μg 合成cDNA。通過ViiA 7 qRT-PCR 系統進行qRT-PCR 反應，引物序列見表1。PCR 反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共計40 個循環。β-actin 為mRNA 表達的內參，每個樣本檢測3 次，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

當前國際上與自由貿易區域有關的概念多達20多種，其中一部分屬于雙邊或多邊貿易體系，包括世貿組織框架下的自由貿易區(FTA，Free Trade Area)，其余部分屬于單邊自由貿易區范疇，包括我國即將設立的自由貿易港。自全球第一家自由貿易港誕生至今，自由貿易港口經歷了從轉口貿易到加工貿易，再到綜合型貿易港的演變過程。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7 Western blotting

將Vector shRNA或p21 shRNA轉染OPCs細胞6 h，然后在分化培養基中培養3 d。轉染后第4 天，用冷PBS 洗滌少突膠質細胞，然后在NP-40 裂解緩沖液中裂解。4℃、12 000 r/min 離心10 min，裂解液通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上。用5%牛奶封膜，并用p21（1∶200）或β-actin 的一抗檢測，用相應的二抗孵育膜。使用增強化學發光檢測試劑盒對膜進行可視化檢測。

1.8 shRNA轉染

為確定p21 在少突膠質細胞周期調控中的作用，本實驗采用shRNA 介導敲低p21 的表達。用p21 shRNA 或空載體進行Western blotting 檢測以確定轉染效率。p21 shRNA 質粒由3 個靶向特異性載體質粒組成。實驗前，將OPCs 細胞在增殖培養基中保存48 h。然后將增殖培養基替換為轉染培養基。將共1 μg p21 shRNA 或1 μg 對照shRNA 和轉染試劑添加到培養基中。根據細胞轉染情況將細胞分為對照組（正常培養），空載體組（將1 μg 對照shRNA 轉染到細胞系中），p21 shRNA 組（將1 μg p21 shRNA 轉染到細胞系中），OPCs 孵育6 h。增殖實驗中，轉染6 h 后用增殖培養基替換原培養基，加入BrdU 10 μg/ml 孵育12 h。在分化實驗中，轉染6 h 后將培養基換成含有1 μg/ml 嘌呤霉素抗生素的分化培養基，以殺死未轉染的細胞。第4 天，對OPCs 細胞進行Western blotting、細胞周期分布和免疫細胞化學檢測。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 和GraphPad Prism version 7.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用Bonferroni 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 喹硫平對PDGF 促進細胞有絲分裂有抑制作用

對照組、PDGF 組、喹硫平組和PDGF+喹硫平組的G0/G1 期、S 期和G2 期細胞百分比比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較：與對照組比較，PDGF 組G0/G1 期細胞百分比低（P<0.05），S 期和G2 期細胞百分比高（P<0.05），說明PDGF 促進細胞有絲分裂；與PDGF 組比較，PDGF+喹硫平組G0/G1 期細胞百分比高（P<0.05），S 期和G2 期細胞百分比低（P<0.05），說明喹硫平對PDGF 促進細胞有絲分裂有抑制作用。見表2。

表2 喹硫平抑制PDGF促進細胞有絲分裂作用 （%，x±s）

2.2 喹硫平促進細胞周期退出并阻斷PDGF 的作用

對照組、PDGF 組、喹硫平組和PDGF+喹硫平組的細胞周期退出指數分別為（0.11±0.02）、（0.06±0.01）、（0.15±0.02）和（0.11±0.01），經方差分析，差異有統計學意義（F=8.944，P=0.000）。進一步兩兩比較：與對照組比較，PDGF 組細胞周期退出指數低（P<0.05），喹硫平組細胞周期退出指數高（P<0.05），說明PDGF 抑制細胞周期退出，喹硫平促進細胞周期退出；與PDGF 組比較，PDGF+喹硫平組細胞周期退出指數高（P<0.05），說明喹硫平阻斷PDGF 對細胞周期退出的影響。

2.3 喹硫平促進OPCs細胞分化

在高分化細胞中，對照組、喹硫平10 μmol/L組和喹硫平20 μmol/L 組高分化和低分化細胞數比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較：與對照組比較，喹硫平10 μmol/L 組和喹硫平20 μmol/L 組高分化細胞數高（P<0.05），低分化細胞數量低（P<0.05），表明喹硫平可提高OPCs 細胞的成熟率，降低低分化細胞數。見表3。

表3 喹硫平促進OPCs細胞分化 （%，±s）

表3 喹硫平促進OPCs細胞分化 （%，±s）

注：?與對照組比較，P<0.05。

組別低分化細胞高分化細胞對照組喹硫平10 μmol/L組喹硫平20 μmol/L組F 值P 值63.12±5.47 42.06±4.32?21.07±3.04?21.249 0.000 10.05±1.02 30.13±2.37?50.00±5.15?22.054 0.000

2.4 喹硫平上調p21 mRNA的表達

兩組p21 mRNA 相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），喹硫平組高于對照組，表明喹硫平干預后p21 表達升高；而其他mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

表4 兩組mRNA相對表達量比較 （±s）

表4 兩組mRNA相對表達量比較 （±s）

注：?與對照組比較，P<0.05。

組別Rb1 mRNA cdk2 mRNA Cdk4 mRNA P27 mRNA Ccnd1 mRNA P53 mRNA P21 mRNA E2f2 mRNA對照組喹硫平組t 值P 值0.38±0.03 0.41±0.05 1.627 0.121 0.02±0.01 0.03±0.01 1.412 0.171 0.08±0.03 0.07±0.01 1.000 0.331 0.04±0.02 0.03±0.01 1.414 0.174 0.03±0.01 0.04±0.02 1.414 0.174 0.07±0.02 0.08±0.03 0.877 0.392 0.51±0.03 1.15±0.05?34.709 0.000 0.03±0.01 0.05±0.03 2.000 0.061

2.5 下調p21對OPCs細胞周期分布的影響

對照組、空載體組和p21 shRNA 組p21 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較：與對照組和空載體組比較，p21 shRNA 組p21 蛋白相對表達量低（P<0.05）。見表5 和見圖1。

圖1 各組p21蛋白的表達

對照組、空載體組、p21 shRNA 組S 期和G2 期細胞百分比比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較：與空載體組和對照組相比，p21 shRNA 組S 期細胞百分比高（P<0.05），G2 期細胞百分比低（P<0.05），表明下調p21 可增加S 期細胞百分比，降低G2 期細胞百分比。見表5。

表5 各組p21蛋白相對表達量和細胞周期比較 （±s）

表5 各組p21蛋白相對表達量和細胞周期比較 （±s）

注：?與p21 shRNA組比較，P<0.05。

組別G2期/%p21蛋白S期/%對照組空載體組p21 shRNA組F 值P 值3.02±0.21?2.85±0.24?1.13±1.13 5.206 0.000 0.38±0.05?0.36±0.03?0.21±0.02 9.983 0.000 7.05±0.72?8.00±0.85?13.12±1.08 14.788 0.000

2.6 下調p21對少突膠質細胞增殖的影響

對照組、空載體組和p21 shRNA 組的BrdU 陽性細胞率分別為（30.12±3.05）%、（33.21±4.17）%和（44.25±3.68）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=5.469，P=0.000）。進一步兩兩比較：p21 shRNA 組BrdU 陽性細胞率高于對照組和空載體組（P<0.05），表明下調p21 可增加BrdU 陽性細胞，促進少突膠質細胞增殖。

2.7 下調p21對少突膠質細胞分化的影響

對照組、空載體組和p21 shRNA 組MBP 陽性細胞率分別為（39.24±4.07）% 、（32.19±3.33）% 和（18.54±2.28）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=9.762，P=0.000）。進一步兩兩比較：p21 shRNA組MBP 陽性細胞率低于對照組和空載體組（P<0.05），表明下調p21 可降低MBP 陽性細胞，抑制少突膠質細胞分化。

3 討論

精神分裂癥是一種臨床上常見的慢性、致殘性精神疾病，主要特征表現為情感、思維、行為、意志障礙等[13]。精神分裂癥具有發病率高、致殘率高、治愈率低等特點，給臨床治療和護理造成巨大的壓力，同時也給社會和患者家庭帶來沉重的經濟負擔[14]。目前，普遍認為精神分裂癥是由遺傳和環境因素相互作用所致，但其發病機制仍尚未完全了解。本研究通過探討非典型抗精神病藥物奎硫平在體內外對少突膠質細胞周期調節的影響，發現喹硫平可以促進細胞周期的退出，加速少突膠質細胞的分化，另外，喹硫平治療可使小鼠前額皮質p21 mRNA 顯著升高，下調p21 的表達增強細胞的增殖和延遲分化。

據報道，在精神分裂癥患者中，CyclinD1、D2、E 和Cyclin A2 等細胞周期陽性調節因子的mRNA 相對表達量明顯上調，而周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27 mRNA 和p57 mRNA 相對表達量顯著下調[15]。另有研究表明，暴露在草酸雙下的小鼠少突膠質細胞周期調節因子（包括Cyclin A2、CyclinD1 和CyclinF）的表達水平明顯上調[16]。由此可見，細胞周期基因表達的異常可能是精神分裂癥和銅中毒小鼠少突膠質細胞缺失的原因之一。此外，經過草酸雙干預的小鼠表現出較高水平的標記為NG2 和血小板衍生的生長因子α 的OPCs，以及成熟少突膠質細胞數的明顯減少[17-18]。而在草酸雙誘導的去髓細胞模型中，OPCs 細胞為何不能進一步分化為成熟少突膠質細胞尚不清楚。生長因子的異常分泌和細胞周期的激活似乎是阻礙OPCs 細胞分化的重要機制。PDGF 和bFGF 可促進OPCs 增殖，抑制其分化[19]。FGF2 甚 至可以刺激有絲分裂后少突膠質細胞重新進入細胞周期的S 期[20]。細胞周期的激活可使OPCs 處于增殖狀態，導致OPCs 分化的缺失，此外，細胞周期退出失敗可導致少突膠質細胞凋亡，阻礙少突膠質細胞分化[21]。有研究指出，抑制PDGF 受體信號可以促進少突膠質細胞分化[22]。本研究發現，PDGF 可防止OPCs 從細胞周期中退出（抑制細胞周期退出），增加S 期和G2 期細胞數。10 μmol/L 喹硫平可刺激OPCs細胞周期退出，抑制PDGF 誘導的細胞周期激活。由于細胞周期退出是細胞分化的前提條件，喹硫平可通過調節少突膠質細胞的細胞周期進程，促進少突膠質細胞分化，減輕髓鞘脫髓。

p21 是一種細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑，能夠影響所有的細胞周期蛋白復合物[23]。p21 與細胞周期退出增加有關，而下調p21 可導致少突膠質細胞周期退出減少[24]。與此相反，p21 還可以作為一種正向的細胞周期調節劑，通過促進活性周期蛋白D1/CDK4 復合物，刺激少突膠質細胞的S期進入細胞周期[25]。本實驗使用shRNA 敲低p21 的表達，觀察到OPCs 增殖數量明顯增加（BrdU+標記）和成熟少突膠質細胞數量顯著減少（MBP 標記）。可見p21 作為細胞周期的負調控因子，可能有利于奎硫平促進OPCs 細胞分化的作用。

既往研究表明，非典型抗精神病藥物奧氮平可通過阻滯膠質瘤干細胞（GSCs）周期，抑制其增殖并誘導其向少突膠質細胞分化[26]。此外，喹硫平還能通過促進GSCs 向少突膠質細胞分化，有效抑制GSCs 啟動的腫瘤生長，發揮抗膠質瘤的作用[27]。由此可見，抗精神病藥物喹硫平可能是臨床治療脫髓鞘疾病和惡性膠質瘤的一種有效藥物。雖然抗精神病藥物喹硫平在體外能夠有效調節少突膠質細胞的細胞周期進程，促進少突膠質細胞分化，減輕髓鞘脫髓，但是在體內能否對p21 起到有效的調節作用，仍需要進一步的驗證。綜上所述，喹硫平可能通過調節少突膠質細胞的細胞周期來調節少突膠質細胞的分化。