利用分子標記輔助選擇技術創制耐鋁玉米種質

鄧磊 潘金衛 楊文鵬 任洪 王偉 柏光曉

摘要：【目的】將耐鋁主效基因導入普通玉米自交系，篩選出耐鋁玉米株系，為拓寬玉米耐鋁種質資源及耐鋁育種提供理論參考。【方法】以玉米耐鋁材料（CML530、CML532、CML533和CML534）和普通玉米自交系（西1、9058和LX9801）為材料，構建6個回交群體，基于分子標記輔助選擇技術，利用與耐鋁基因ZmM1、ZmM2、ZmASL和ZmALMT2緊密連鎖的分子標記（umc1468、ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496）進行靶基因選擇，將耐鋁主效基因導入到普通玉米自交系，結合植株田間表現，篩選出耐鋁的穩定株系，并對其進行耐鋁鑒定。【結果】在分離世代（BC1F1/S1）苗期對6個回交群體共581個株系進行靶基因選擇，結果有69個株系中選，結合植株田間表現，最終獲得17個穩定株系。基于分子標記檢測結果，17個穩定株系的遺傳背景恢復率為73.9%～93.8%，平均為83.4%。0.2 mmol/L AlCl3溶液處理下17個穩定株系的根系生長均受到不同程度的抑制，根凈增長度平均值為0.81 cm，極顯著低于對照（0.5 mmol/L CaCl2溶液）（P<0.01，下同）;穩定株系的根相對伸長率與輪回親本差異達極顯著水平;17個穩定株系的根相對伸長率為64.50%～83.33%，平均為74.74%，均為中等及以上耐鋁株系，其中NS1、NS9、NS10、NS15和NS16為高耐鋁株系。【結論】通過分子標記輔助選擇技術可將耐鋁主效基因導入普通玉米自交系，且導入多個耐鋁基因株系的耐鋁性較同一群體中導入單個耐鋁基因的株系均有不同程度提高，表明多個耐鋁基因累加可提高耐鋁性。可見，該技術可作為耐鋁玉米種質創制的有效手段。

關鍵詞： 玉米;分子標記輔助選擇;酸性土壤;耐鋁性

中圖分類號： S513.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-0908-08

Breeding aluminum-tolerant maize germplasm using

molecular marker-assisted selection

DENG Lei1， PAN Jin-wei1， YANG Wen-peng2， REN Hong2， WANG Wei2*， BAI Guang-xiao1*

（1College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang? 550025， China; 2Institute of Upland Food Crops，

Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang? 520100， China）

Abstract：【Objective】The main-effect genes for aluminum（Al） tolerance were introgressed into common maize inbred lines， maize germplasms with Al tolerance were selected so as to provide reference for broadening Al-tolerant maize germplasms and breeding of Al-tolerant maize germplasms. 【Method】Six backcross populations were constructed with Al-tolerant maize materials（CML530，CML532，CML533 and CML534） and common maize inbred lines（Xi1，9058 and LX9801）. Based on molecular marker-assisted selection （MAS），the targeted genes were selected using molecular mar-kers（umc1468，ZmMATE1，ZmMATE2，MateF2 and ALMT93496） closely linked to Al-tolerant genes（ZmM1， ZmM2， ZmASL and ZmALMT2）. The main-effect genes for Al tolerance were introgressed into common maize inbred lines， combined with the field performance， the stable lines were selected and? Al-resistance was identified. 【Result】In separated generation（BC1F1/S1），581 individuals were screened out from 6 populations at seedling stage using MAS，and a total of 69 individuals were selected. Combined with the field performance，17 stable lines were finally obtained. The recovery rate of genetic background based on molecular markers was 73.9%-93.8%，with an average of 83.4%. Under the treatment of 0.2 mmol/L AlCl3 solution， the growth of the roots of 17 stable lines was inhibited to varying degrees. The average net growth of the roots was 0.81 cm， which was extremely significantly lower（P<0.01， the same below） than that of the control（0.5 mmol/L CaCl2 solution）. The relative elongation of the roots of the stable lines showed extremely significant difference from that of the recurrent parent. The identification of Al tolerance at seedling stage showed that the relative root elongation rate of 17 selected lines ranged from 64.50% to 83.33%，with an average of 74.74%. All of them were medium or above Al-tolerant lines，NS1，NS9，NS10，NS14 and NS16 of which were highly Al-tolerant lines. 【Conclusion】Molecular marker-assisted selection technique helps introgress? the Al-tolerant major-effect genes into the normal maize inbred line. Moreover， the Al tolerance of inbred lines taking in more than one Al-tolerant genes is better than lines in the same population taking in a single Al-tolerant gene. Therefore， the accumulation of multiple Al-tolerant genes enhances the level of Al tolerance. The technology can serve as an effective method for the breeding of Al-tolerant maize germplasm.

Key words： maize; molecular marker-assisted selection; acid soil; aluminum tolerance

Foundation item： Science and Technology Plan Project of Guizhou（QKHZC〔2020〕1Y050）; Guizhou High-level Innovative Talent Cultivation Object Project（20154017）

0 引言

【研究意義】玉米是世界上分布最廣的作物之一。鋁毒害脅迫是生長于酸性土壤中玉米產量的主要限制因子，其危害僅次于干旱脅迫，嚴重影響玉米產業的發展（Liu et al.，2014）。世界上酸性土壤面積約占全世界陸地總面積的35%，占耕地總面積的50%（Ryan and Delhaize，2010;廖紅和嚴小龍，2013）。我國酸性土壤面積達2.04×108 ha，約占耕地面積的21%，主要集中在長江以南的熱帶、亞熱帶地區（秦松等，2009;趙天龍等，2013）。研究發現，當土壤pH<5時，鋁溶解變成Al3+，經Ca2+通道進入作物根細胞內，誘導細胞產生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）并造成細胞壁僵化，導致根的生長受到抑制，從而阻礙作物生長發育（肖厚軍和王正銀，2006;林鄭和和肖榮冰，2009;Ryan et al.，2011）。生產上迫切需要耐鋁玉米種質，但目前自然界中幾乎不存在天然的耐鋁種質，主要通過人工選擇獲得耐鋁突變體。因此，利用分子標記輔助選擇技術創制耐鋁玉米種質，對玉米產業發展具有重要意義。【前人研究進展】近年來，玉米耐鋁毒的分子遺傳學研究發展非常迅速。研究發現，玉米的耐鋁性是數量性狀，受多基因累加影響（Borrero et al.，1995）。研究較多的耐鋁基因為蘋果酸和檸檬酸的轉運蛋白基因，分別屬于鋁激活蘋果酸轉運蛋白（Al-Activated Malate Transporter，ALMT）和多藥及毒性復合物排出轉運蛋白（Multidrug and toxin extrusion，MATE）家族（Yan et al.，2020;宋鑫等，2021）。Ninamango-Cárdenas等（2003）利用QTL作圖定位了5個與玉米耐鋁毒相關的QTL，可解釋60%的遺傳變異。解光寧（2012）研究發現ZmSTAR1和ZmSTAR2基因編碼耐鋁毒ABC轉運蛋白，參與玉米中的鋁毒脅迫響應，是與玉米耐鋁性相關的轉錄因子。目前獲得耐鋁玉米種質的途徑較少，部分學者通過從自交系和地方特色品種中尋找基因資源，并結合耐鋁性鑒定篩選獲得（許玉鳳等，2005;Coelho et al.，2016;林金利等，2020），關于耐鋁新種質創制的報道較少。為了加快玉米耐鋁性育種進程，拓寬耐鋁玉米種質，國內外學者在玉米耐鋁分子標記方面開展了大量研究。Maron等（2010）根據玉米耐鋁性的主效基因ZmM1和ZmM2，開發出2個Indel分子標記即ZmMATE1和ZmMATE2。王偉等（2014）將ZmM1和ZmM2基因附近的分子標記進行整合，并結合分子標記的多態性和遺傳連鎖關系進行分析，結果發現通過ZmM1和ZmM2基因進行分子標記輔助選擇時，宜選擇ZmMATE1、ZmMATE2和umc1468分子標記進行檢測。Krill等（2017）通過關聯分析篩選出4個與玉米耐鋁性相關的基因，即玉米AltsB蛋白類似物基因（Zea mays AltSB like，ZmASL）、玉米鋁激活蘋果酸2號轉運蛋白基因（Zea mays aluminum-activated malate transporter2，ZmALMT2）、S-腺苷-L-高半胱氨酸酶基因（S-adenosyl-L-homocysteinase，SAHH）和蘋果酸酶基因（Malic enzyme，ME），并開發了對應的Indel分子標記，可用于耐鋁玉米材料的分子標記輔助選擇。Matonyei等（2014）在選育玉米耐鋁材料時發現，應將多個耐鋁基因進行聚合，而不是單一基因滲入。【本研究切入點】雖然通過分子生物學手段可提高玉米在酸性土壤中的耐鋁性能并拓寬耐鋁玉米種質，但目前鮮見利用分子標記輔助選擇技術創制玉米耐鋁種質的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以玉米耐鋁材料和普通玉米自交系為材料，利用分子標記輔助選擇技術將耐鋁主效基因導入普通玉米自交系中，從中篩選獲得耐鋁的新材料，為拓寬玉米耐鋁種質資源及耐鋁育種提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

4份玉米耐鋁材料來源于國際玉米小麥改良中心（CIMMYT），3份普通玉米自交系來源于貴州省旱糧研究所（表1）。以玉米耐鋁材料為供體親本，普通玉米自交系為輪回親本，構建6個回交群體：CML530/LX9801//LX9801、CML532/西1//西1、CML532/9058// 9058、CML533/西1//西1、CML533/9058//9058和CML 534/LX9801//LX9801。主要試劑：CTAB、無水乙醇、異丙醇、氯仿/異戊醇（24∶1）、TBE、Bis-acrylamide和Acrylamide等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，6×Loading Buffer和DL500 DNA Marker購自重慶擎科興業生物技術有限公司。主要設備儀器：移液器（Eppendorf，德國）、高速冷凍離心機（Beckman，美國）、恒溫水浴鍋（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、NanoDrop One型超微量紫外分光光度計（Thermo，美國）、Bio-6000型掃描儀（上海中晶企業發展有限公司）、SimpliAmp PCR儀（ABI，美國）、垂直電泳槽[京昌科儀（北京）生物科技有限公司]和DYY-10C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA提取 采用王偉等（2008）改良的CTAB法提取基因組DNA，用NanoDrop One型超微量紫外分光光度計檢測DNA濃度和質量。

1. 2. 2 靶基因選擇及遺傳背景分析 于苗期取分離世代幼嫩葉片，提取基因組DNA。參考前人（Maron et al.，2010;王偉，2014;Krill et al.，2017）的研究結果，利用SSR分子標記（umc1468）和Indel分子標記（ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496）進行耐鋁主效基因選擇及鑒定，篩選出穩定株系，參照農業標準NY/T 1432─2014《玉米品種鑒定技術規程SSR標記法》，利用40對SSR分子標記引物進行其遺傳背景分析，篩選出耐鋁的穩定株系。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。耐鋁主效基因及其分子標記（Maron et al.，2010;王偉等，2014;Krill et al.，2017）如表2所示。SSR和Indel分子標記的PCR反應體系、擴增程序、電泳檢測和染色參考王偉等（2008，2014）的方法進行。

1. 2. 3 耐鋁性鑒定 參考李德華等（2004）的方法對穩定株系進行耐鋁性鑒定：以0.5 mmol/L CaCl2溶液（pH 4.5）處理的株系為對照組（CK）、0.2 mmol/L AlCl3溶液（含0.5 mmol/L CaCl2，pH 4.5）處理的株系為處理組，每樣品設3個重復，每個重復5株幼苗，測量處理前后主根長度，計算根凈增長度（LNSR）和根相對伸長率（LRSR），計算公式為：LNSR=L處理后-L處理前，LRSR=LNSR（Al）/LNSR（CK）×100。根據根的相對伸長率將耐鋁性分為3個等級：高耐鋁（LRSR≥80.0%）、中等耐鋁（60.0%≤LRSR<80.0%）和鋁敏感（LRSR<60.0%）。

1. 3 統計分析

基于分子標記的遺傳背景恢復率采用公式G（g）=[L+X（g）]/（2L）計算，理論背景恢復率按公式E[G（g）]=1-（1/2）g+1計算（方明鏡等，2005）。式中，g指回交世代數;G（g）指在回交g代的遺傳背景恢復率;X（g）指在回交g代表現為受體親本帶型的分子標記數量;L指所參與分析的分子標記數量。利用Excel 2019和IBM SPSS Statistics 23進行數據整理分析。

2 結果與分析

2. 1 耐鋁主效基因的分子標記多態性檢測及篩選

利用SSR和Indel分子標記對供試材料在4個耐鋁主效基因的分子標記進行多態性檢測，結果如圖1所示。供試材料中，不同的耐鋁主效基因的分子標記多態性存在明顯差異。在ZmMATE1位點，CML530與LX9801間、CML533與9058間及CML532與西1間均存在多態性，CML532與9058間、CML533與西1間及CML534與LX9801間均無多態性;在ZmMATE2位點，CML530和CML534分別與LX9801無多態性，CML532和CML533分別與西1具有多態性，CML532和CML533分別與9058具有多態性;在umc1468、MateF2和ALMT93496位點，CML530和CML534分別與LX9801具有多態性，CML532和CML533分別與西1，CML532和CML533分別與9058具有多態性。根據多態性檢測結果，選擇SSR分子標記umc1468對群體CML532/西1//西1、CML533/9058//9058和CML534/LX9801//LX9801進行靶基因選擇，分別利用Indel分子標記ZmMATE2、MateF2和ALMT93496對群體CML532/9058//9058、CML530/LX9801//LX9801和CML533/西1//西1進行靶基因選擇。

2. 2 分離世代靶基因選擇

利用玉米耐鋁材料和普通玉米自交系雜交獲得F1，用普通玉米自交系回交獲得BC1F1群體。種植BC1F1，于盛花期進行人工混合授粉，獲得分離世代（BC1F1/S1）。種植BC1F1/S1，于苗期取樣，利用SSR分子標記umc1468和Indel分子標記ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496進行靶基因選擇，結果如圖2所示。在6個群體581個株系中，共有69個株系電泳帶型與非輪回親本一致，稱為中選株系，根據田間植株性狀表現，去除雌雄不協調未能授粉的株系，共獲得17個穩定株系。其中，以LX9801為輪回親本的2個群體（CML530/LX9801//LX9801和CML534/LX9801//LX9801）中，中選株系18個，實際收獲6個穩定株系;以西1為輪回親本的2個群體（CML532/西1//西1和CML533/西1//西1）中，中選株系17個，實際收獲7個穩定株系;以9058為輪回親本的2個群體（CML532/9058//9058和CML533/9058//9058）中，中選株系34個，實際收獲4個穩定株系（表3），繼續種植自交加代直至穩定。

利用Indel分子標記ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496鑒定17個穩定株系的耐鋁基因型，結果如圖3所示。在17個穩定株系中，有5個株系滲入ZmMATE1位點，8個株系導入ZmMATE2位點，4個株系滲入MateF2位點，3個株系導入ALMT93496位點，其中株系NS1導入ZmMATE1和MateF2 2個耐鋁位點，NS8滲入ZmMATE1和ZmMATE2 2個耐鋁位點，NS15滲入ZmMATE2和ALMT93496 2個耐鋁位點（表4）。

2. 3 遺傳背景分析

利用獲得的穩定株系對40對SSR分子標記進行多態性篩選，選擇在親本間具有明顯多態性且帶型清晰可辨的分子標記，對17個穩定株系進行遺傳背景分析，結果如表5所示。分離世代的遺傳背景恢復率理論值為75.0%。在17個穩定株系中，基于分子標記的遺傳背景恢復率為73.9%～93.8%，平均為83.4%，比理論值高8.4%（絕對值）;多數穩定株系的遺傳背景恢復率高于理論值，最高的是來自群體CML532/西1//西1的NS5和NS7及群體CML532/9058//9058的NS9，背景恢復率均為93.8%。

2. 4 穩定株系的耐鋁性鑒定

根尖是鋁毒作用的主要位點，鋁毒害脅迫下根伸長受抑制程度是評價植物耐鋁性的重要指標（張莉麗等，2007）。對獲得的穩定株系進行耐鋁性鑒定，結果如表6所示。處理組17個穩定株系的根系生長均受到不同程度的抑制，根凈增長度平均值為0.81 cm，極顯著低于對照（1.10 cm）（P<0.01，下同）;穩定株系的根相對伸長率與輪回親本差異達極顯著水平。17個穩定株系的根相對伸長率為64.50%～83.33%，平均為74.74%，根相對伸長率最低的株系是來自CML532/西1//西1群體的NS5，根相對伸長率最高的株系是來自群體CML532/9058//9058的NS9。17個穩定株系耐鋁性均達到中等及以上水平，其中NS1、NS9、NS10、NS15和NS16耐鋁性最強，為高耐鋁株系。

3 討論

對于酸性土壤地區，鑒選和創制玉米耐鋁種質是提高玉米產量的有效途徑。Matonyei等（2014）通過檢測112份肯尼亞玉米種質的根相對伸長率、根尖鋁含量及玉米鋁耐性基因ZmMATE1的表達水平，共獲得1個高耐鋁的玉米自交系。Coelho等（2016）通過對102份玉米種質進行耐鋁性鑒定，獲得17份耐鋁基因型種質。本研究利用分子標記輔助選擇技術將耐鋁主效基因導入到普通玉米自交系中，獲得了17個穩定耐鋁材料，經苗期鑒定發現，其均達中等及以上耐鋁等級，可為玉米耐鋁育種提供基礎材料。

玉米耐鋁性是數量性狀，受多基因累加影響（Borrero et al.，1995）。Matonyei等（2014）對112份肯尼亞玉米種質進行耐鋁基因ZmMATE1表達分析及耐鋁性鑒定，結果發現CON5和Cateto 2個種質的耐鋁性均較好，但CON5中ZmMATE1基因的表達量只有Cateto的50%，推測CON5中存在多個耐鋁基因。本研究中，穩定株系NS1、NS8和NS15均滲入2個耐鋁位點，相較同一群體中導入單個耐鋁位點的株系，其耐鋁性均有不同程度提高，表明多個耐鋁基因累加可提高耐鋁性，與Matonyei等（2014）的研究結果相似。

作物受到鋁毒害的主要表現為根生長受到抑制，因此根的生長受抑制程度是評價作物耐鋁性的重要指標（熊潔等，2015;刑承華等，2017）。李德華等（2004）研究發現，玉米自交系根凈增長度與耐鋁性相關性較差，而根相對伸長率與其耐鋁性呈顯著相關性，耐鋁基因型種子根相對伸長率較大。唐新蓮等（2015）以56個玉米品種（包含普通玉米、甜玉米和糯玉米）為材料，經10～30 μmol/L Al3+溶液（含0.5 mmol/L CaCl2，pH 4.5）處理后，玉米幼苗根凈增長量均較對照（0 μmol/L Al3+，0.5 mmol/L CaCl2，pH 4.5）顯著降低，且Al3+濃度與根系受抑制程度呈顯著正相關，不同玉米品種的耐鋁性存在顯著差異。林雪瓊等（2021）研究發現，在鋁脅迫下甜玉米根系相對伸長量明顯下降，表明其根系伸長受到Al3+的明顯抑制，而耐鋁性較強的甜玉米自交系，其根系相對伸長率有所上升。本研究中，鋁處理后17個穩定株系根相對伸長率均極顯著高于輪回親本，但高耐鋁株系NS9的根凈增長度低于中等耐鋁株系NS5，與李德華等（2004）的研究結果一致。因此，在利用分子標記輔助選擇技術創制耐鋁種質時，不僅要考慮耐鋁主效QTL（或基因）的分子標記檢測的準確性，還應對獲得的穩定株系進行耐鋁性鑒定，二者結合才能獲得更優異的耐鋁種質。

4 結論

通過分子標記輔助選擇技術可將耐鋁主效基因導入普通玉米自交系，且滲入多個耐鋁基因株系的耐鋁性較同一群體中導入單個耐鋁基因的株系均有不同程度提高，表明多個耐鋁基因累加可提高耐鋁性。可見，該技術可作為耐鋁玉米種質創制的有效手段。

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（責任編輯 陳 燕）