番茄Trihelix家族SIP1亞家族基因（SlGT-33）克隆表達分析及功能研究

崔寶祿 陳國平

崔寶祿（1979-），副教授，主要從事番茄分子生物學研究工作。先后主持國家自然科學基金地區項目“黃單胞菌效應因子AvrBS3靶基因SlUPA-like調控植物畸形發育的機理研究”、貴州省基礎研究項目“番茄SlUPA-like基因提高防御黃單胞桿菌病害的研究”、貴州省拔尖人才項目“番茄Trihelix轉錄因子GT-2亞家族SlGTL5基因應答非生物脅迫的分子機制研究”、貴州省農業重大產業科技攻關項目“校農結合扶貧點蔬菜立體栽培與采后處理技術示范”等科研項目10余項;申報國家專利10項，已授權發明專利1項，實用新型專利3項;以第一作者或通訊作者在《Scientific Reports》《Plant Physiology & Biochemistry》《Crop Science》《南方農業學報》《西北植物學報》《分子植物育種》等期刊上發表科技論文10余篇。

摘要：【目的】對番茄三螺旋（Trihelix）家族SIP1亞家族基因（SlGT-33）進行克隆表達及功能研究，為深入解析SIP1亞家族成員調控植物生長發育機制及選育矮化番茄品種提供理論依據。【方法】以番茄品種AC++為材料，PCR擴增SlGT-33基因，對其進行序列分析，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測SlGT-33基因在不同組織及外源激素和非生物脅迫下的表達模式，并利用RNAi技術鑒定SlGT-33基因的生物學功能。【結果】擴增獲得的SlGT-33基因（GenBank登錄號Solyc12g043090）開放閱讀框（ORF）為1125 bp，編碼374個氨基酸殘基，與已知同源基因序列（GenBank登錄號XP004252336.1）僅缺少3個堿基。SlGT-33與SlGT-17（GenBank登錄號Solyc05g018350）位于同一分支，雖然二者的氨基酸序列相似性最高，但僅為45.8%。SlGT-33基因在莖和成熟葉中的相對表達量較高，顯著高于其他組織（P<0.05，下同）;經IAA、GA3和MeJA處理后，SlGT-33基因的相對表達量均與對照無顯著差異（P>0.05，下同）;SlGT-33基因經ABA處理2～24 h時相對表達量均顯著高于對照。SlGT-33基因在高鹽脅迫和機械損傷下的相對表達量與對照無顯著差異;高溫脅迫和低溫脅迫下SlGT-33基因表達整體上均呈逐漸降低的變化趨勢;在脫水脅迫下SlGT-33基因表達整體上均呈逐漸升高的變化趨勢。通過農桿菌介導轉化法獲得6個SlGT-33-RNAi沉默株系，沉默效率為64%～83%。生長70 d的SlGT-33-RNAi沉默株系RNAi-4和RNAi-5幼苗株高和節間長度均為野生型的60%左右，且復葉結構尺寸明顯變小，花序提前形成。莖尖組織中頂端分生組織關鍵轉錄因子基因KNOX2和WUS基因在SlGT-33-RNAi沉默株系的相對表達量均極顯著（P<0.01）或顯著高于野生型，腺苷酸異戊烯轉移酶（CTK合成的關鍵酶）編碼基因IPT2和莖尖生長點調控基因PHAN基因在2個SlGT-33-RNAi沉默株系的相對表達量均顯著低于野生型。頂端分生組織關鍵轉錄因子基因KNOX1基因在2個SlGT-33-RNAi沉默株系的相對表達量與野生型無顯著差異。SlGT-33-RNAi沉默株系莖尖組織的細胞分裂素（CTK）含量顯著低于野生型。【結論】SlGT-33基因屬于環境敏感型基因，其表達受ABA和脫水脅迫誘導，但受極端溫度的抑制。抑制SlGT-33基因表達會導致了番茄植株矮化和生殖生長加速，其作用機制與頂端分生組織的CTK合成受抑制及莖尖組織調控基因KNOX2、PHAN和WUS的異常表達密切相關。

關鍵詞： 番茄;SlGT-33基因;植株矮化;表達分析;功能研究

中圖分類號： S641.203.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-0857-10

Cloning expression analysis and functions of SIP1 subfamily gene（SlGT-33） in tomato Trihelix family

CUI Bao-lu1， CHEN Guo-ping2

（1The Department of Life Science and Agriculture， Qiannan Normal University for Nationalities， Duyun， Guizhou 558000， China; 2 College of Bioengineering， Chongqing University， Chongqing? 400044， China）

Abstract：【Objective】Cloning expression and function of SIP1 subfamily gene（SlGT-33） of tomato? Trihelix family to provide theoretical basis for analyzing the mechanism of SIP1 subfamily members regulating plant growth and development， and breeding of dwarf tomato varieties. 【Method】Using the tomato variety AC++， amplified its SlGT-33 gene by PCR， performed sequence analysis， and used real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） to detect its expression patterns in different tissues and exogenous hormones and non-biological stress. Finally， the RNAi technique was used to identify the biological function of SlGT-33 gene. 【Result】The length of SlGT-33（GenBank accession number：Solyc12g 043090）open reading frame（ORF） was 1125 bp，encoding 375 amino acids residues， which was short of 3 bp than its homologous gene（GenBank accession number：XP004252336.1）. Phylogenetic analysis suggested that SlGT-33 protein was in the same branch with SlGT-17（GenBank accession number：Solyc05g018350），though the similarity between their amino acids sequence was the highest， the value was only 45.8%. SlGT-33 gene was significantly expressed in stem and mature leaves than other tissues（P<0.05， the same below）. After IAA， GA3， MeJA treatments， the expression of SlGT-33 gene did not differ significantly from control（P>0.05， the same below）. Compared to control，SlGT-33 could be significantly up-regulated by ABA within 2-24 h. SlGT-33 gene expression was not significantly different from control under high salt stress and mechanical damage. The expression of SlGT-33 gene decreased gradually under high temperature stress and low temperature stress，while expression of SlGT-33 gene increased gradually under dehydrationstress. Six SlGT-33-RNAi silent lines were harvested by Agrobacterium-mediated transformation and silence rate varied from 64% to 83%. The plant height and internode length of 70 d SlGT-33-RNAi silent lines decreased to 60% of wild types. The compound leaf structure was significantly smaller and the inflorescence formed in advance. The key transcription factor genes KNOX2 and WUS in stem tip tissue were extremely significantly expressed in the SlGT-33-RNAi silent lines（P<0.01） or significantly higher than the wild type. Adenylate isopentenyl transferase（key enzyme for CTK synthesis） encoded gene IPT2 and the stem tip growth point regulatory gene PHAN were expressed significantly lower in two SlGT-33-RNAi silent linesthan wild type. The expression of the apical biological tissue key transcription factor gene KNOX1 gene was not significantly different compared with in two SlGT-33-RNAi silentlines. Thecytokinin（CTK） of SlGT-33-RNAi silent line stem tip tissue was significantly lower than in the wildtype. 【Conclusion】SlGT-33 gene was sensitive to environment. It can be induced by ABA and dehydration stresses and suppressed by extreme temperature. But suppressed expression of SlGT-33 leads to dwarf plants and accelerating reproductive development，which is related with inhibition of CTK synthesis of apical meristem? and abnormal expressions of stem tip tissue key regulation genes KNOX2， PHAN and WUS.

Key words： tomato; SlGT-33 gene;dwarf plants; expression analysis;? functional study

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960605）;Basic Research Project of Guizhou? Science and Technology Department （〔2018〕1144）;Top-notch Talent Support Project of Guizhou Education Department（Qianjiaohe〔2016〕111）;Major Technical Innovation Project of Qiannan Normal University for Nationalities（QNSY 2018PT001）

0 引言

【研究意義】番茄（Solanum lycopersicom）為多年生草本，在適宜條件下其頂端分生組織可無限生長。合理施用植物生長延緩劑可使植株矮化，抑制頂端無限生長（黃艷花等，2011），但缺乏遺傳穩定性。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，對番茄矮化基因的功能研究也逐步深入，已發現番茄基因組可編碼60多種轉錄因子，其中三螺旋（Trihelix）轉錄因子與植株矮化密切相關（Kaplan-Levy et al.，2012;Liu et al.，2020），因此研究該家族基因的功能對揭示植物生長發育機制及加速番茄矮化品種選育具有重要指導意義。【前人研究進展】Trihelix轉錄因子為植物特有，在植物形態發生、信號轉導和脅迫響應等方面發揮重要作用，其調控機制為Trihelix結構域（螺旋—環/轉角—螺旋—環/轉角—螺旋）特異結合下游基因啟動子的GT元件，進而調控靶基因表達（Liu et al.，2020）。Trihelix轉錄因子家族分為6個亞家族：GT-1、GT-2、SH4、SIP1、GT-γ和GT-δ（Kaplan-Levy et al.，2012），各亞家族成員的生物學功能逐步被鑒定。其中，GT-2亞家族成員的研究較深入，如PTL基因突變后，植株即出現矮化、葉片卷曲、花藥無法開裂等表型（Li et al.，2008），且該基因主要作用于花瓣和萼片等花被器官發育，尤其對花器官的著生部位及方向起決定作用（Griffith et al.，1999;Brewer et al.，2004）;GTL1基因調控毛狀體發育，該基因突變后，葉片毛狀體的DNA含量增加2～3倍（Breuer et al.，2009）;GT-2基因可響應外源激素和非生物脅迫（崔寶祿等，2020）。GT-γ亞家族成員可響應鹽、干旱等非生物脅迫，超表達后可提高植株耐鹽性（Fang et al.，2010）。SIP1亞家族基因的功能研究相對薄弱。煙草NtSIP1含有Trihelix結構域，可促進6b因子的核定位（Kitakura et al.，2002）;擬南芥ASIL1除含有Trihelix結構域外，還含有甘氨酸和脯氨酸富集區，可結合到靶基因啟動子區，抑制種子成熟（Gao et al.，2009），且ASIL1與ASIL2共同抑制胚胎成熟過程，表現為asil1asil2突變體胚胎中葉綠體和葉綠素的積累均有所增加（Barr et al.，2012）。此外，部分學者將C末端融合天冬氨酸/谷氨酸/尿苷激酶的Trihelix轉錄因子劃入SIP1亞家族，且證實其功能可能與葉片暗綠、畸形發育有關;同屬于SIP1亞家族的FRIGIDA-INTERACTING PROTEIN2（FIP2）基因5'端非編碼區（5'-UTR）編碼Trihelix結構域，其功能可能與春化誘導開花相關（Kaplan-Levy et al.，2012）。擬南芥SIP1亞家族蛋白AST1具有調控氣孔開閉、脂質過氧化、細胞失水死亡等功能（Xu et al.，2018）。綜上所述，SIP1亞家族基因參與植物種子形成、生長發育、非生物脅迫等過程。【本研究切入點】番茄具有基因組小、基因組測序完整、遺傳轉化效率高且穩定等諸多優點，但至今鮮見有關番茄SIP1亞家族基因功能的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以番茄品種AC++為材料，PCR擴增其SIPI亞家族基因SlGT-33的開放閱讀框（ORF），對其進行序列分析，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測SlGT-33基因在不同組織及外源激素和非生物脅迫下的表達模式，最后利用RNAi技術鑒定SlGT-33基因的生物學功能，以期解析其調控植株矮化的分子機制，為深入解析SIP1亞家族成員調控植物生長發育機制及選育矮化番茄品種提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

番茄高度自交品種AC++[S. lycopersicom Mill. cv. Ailsa Craig（AC++）]引自重慶大學生物工程學院。高保真酶PrimerStar Max和M-MLV Reverse Transcriptas反轉錄酶購自TaKaRa公司，細胞分裂素（CTK）酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，SYBR Premix Ex Taq II Kit購自Promega公司，其他生化試劑購自重慶凱飛科技有限公司。主要設備儀器包括ChemDoc XRS+凝膠成像系統（Bio-Rad，美國）及CFX96 Real-time PCR 檢測系統（Bio-Rad，美國）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 組織樣品采集 番茄AC++種植于黔南民族師范學院溫室大棚內，光照16 h（27 ℃）和黑暗8 h （19 ℃）。待植株開花結果后，分別選取成熟植株的根（Root，RT）、莖（Stem，ST）、成熟葉（Mature leaf，ML）、花（Flower，FL）和果皮，其中果皮包括綠色果皮（GF）和紅色果皮（RF），分別取自直徑1 cm的果實和破色4 d后的果實。上述材料液氮速凍后置于 -80 ℃冰箱。AC++種子播種于營養缽中，生長35 d后用于外源激素處理和非生物脅迫。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 采取番茄組織樣品用液氮速凍后，采用TRIzol試劑法提取總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA提取質量。以提取的總RNA為模板，采用M-MLV Reverse Transcriptas反轉錄合成cDNA第一鏈，用于后續的基因克隆及表達分析。

1. 2. 3 SlGT-33基因克隆 利用NCBI和茄科基因組數據庫（SGN）的生物信息學搜索，采用NCBI設計引物SlGT-33-all-F和SlGT-33-all-R（表1），以cDNA為模板，PCR擴增SlGT-33基因ORF。反應體系（50.0 μL）：2×PrimerStar Max 25.0 μL， cDNA模板1.0 μL，10 mmol/L正、反向引物（SlGT-33-all-F和SlGT-33-all-R）各1.0 μL，去離子水補足至50.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性5 min;98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行36個循環。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段，并連接至pMD18-T載體上送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 2. 4 生物信息學分析 在SGN和NCBI數據庫中搜索不同植物SIP1家族蛋白的氨基酸序列。將搜索獲得的氨基酸序列進行多重序列比對，根據比對結果確定SIP1亞家族蛋白的保守結構域。基于不同植物SIP1蛋白的氨基酸序列進行系統進化分析，以預測其生物功能。采用MultAlin（http：//multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）將cDNA與基因組進行序列比對，利用NCBI數據庫的CDD網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測SlGT-33蛋白保守區。并以ClustalX和DNAMAN 6.0進行多重序列比對，采用MEGA 10.0.2構建系統發育進化樹。

1. 2. 5 外源激素處理及非生物脅迫 取生長35 d的番茄幼苗，分別對其噴施50 μmol/L吲哚乙酸（IAA）、50 μmol/L赤霉素（GA3）、50 μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、100 μmol/L脫落酸（ABA）和100 μmol/L 1-氨基環丙烷羧酸（ACC），以噴施水為對照，于0、1、2、4、8、12和24 h后取幼苗中部葉片進行液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存備用（Zhu et al.，2014）。設3次重復。

AC++種子播種于營養缽中，待生長35 d后獲得番茄幼苗，分別對其進行高鹽（以20 mmol/L NaCl緩慢澆灌到植物根部，直至鹽水從花缽下面流出）、高溫（40 ℃）、低溫（4 ℃）、脫水（在水中緩慢清洗幼苗根系土壤，直至洗脫干凈，置于室溫下自然失水）和機械損傷（用剪刀剪碎葉片）等非生物脅迫處理，以未處理幼苗為對照，分別于脅迫0、1、2、4、8、12、24和36 h后選取處理幼苗的中部葉片，經液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用（Pan et al.，2012）。設3次重復。

1. 2. 6 基因表達分析 以cDNA為模板，qRT-PCR檢測SlGT-33基因在不同組織及非生物脅迫和植物激素處理下的表達模式，并檢測SlGT-33基因的下游基因表達情況 ，包括腺苷酸異戊烯轉移酶（CTK合成的關鍵酶）基因（IPT2）、莖尖生長點調控基因（PHAN）及頂端分生組織關鍵轉錄因子基因（KNOX1、KNOX2和WUS）。其中，不同組織SlGT-33基因及其下游基因表達分析以SlCAC基因為內參基因，不同非生物脅迫和植物激素處理下基因表達分析以SlEF1a基因為內參基因，其引物如表1所示。qRT-PCR反應體系：5.0 μL 2×SYBR PreMixs，10 μmol/L正、反向引物（qSlGT-33-F和qSlGT-33-R）各0.5 μL，1.0 μL cDNA模板，以去離子水補足至10.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，進行36個循環。

1. 2. 7 基因沉默載體構建及沉默株系鑒定 經過NCBI生物信息學分析比對，從SlGT-33基因中鑒定其特異序列，并根據1.2.3中高保真PCR擴增方法得到長度為455 bp的片段，將該片段連接至pMD18-T載體上送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序正確后，采用EcoR I/Kpn I和Xba I/Hind III雙酶切方式將該片段以正向和反向的方式連接至中間載體pHANNIBAL上，然后連接至終載體pBIN19上，最后轉化農桿菌LBA4404。經番茄子葉侵染、愈傷組織培養和SlGT-33-RNAi沉默株系鑒定，獲得沉默株系T0代，收集T0代種子，播種后得到T1代植株。

1. 2. 8 CTK含量測定 番茄植株內CTK含量測定：稱取沉默株系和野生型植株成熟葉片0.5 g，用濾紙吸水后，液氮研磨，用80%甲醇抽提，1000 r/min離心20 min，取上清液，用孔徑為0.45 ?m的濾膜清除雜質后，按照ELISA試劑盒說明進行操作，最后用酶標儀在波長450 nm下測定吸光值（OD）。通過建立標準曲線法確定沉默株系和野生型植株成熟葉片中的CTK含量。

1. 3 統計分析

利用Excel 2010對試驗數據進行整理分析，采用SPSS 20.0進行方差分析，誤差代表樣本數為3時的標準誤差，并以t分布進行檢測。

2 結果與分析

2. 1 SlGT-33基因克隆及編碼蛋白氨基酸序列分析結果

以番茄AC++的cDNA為模板擴增得到SlGT-33基因的ORF為1125 bp，共編碼374個氨基酸殘基，與已知番茄品種1706的同源基因序列（GenBank登錄號XP004252336.1）（Yu et al.，2015）相比，僅在第61～63位少3個堿基，GenBank登錄號為XP00425 2336.1。多重序列比對分析結果（圖1）顯示，SlGT-33蛋白含有Trihelix結構域[由第一、二和三螺旋（Helix）組成]、第四螺旋、中央結構域（Central domain）和核定位信號（NLS），且高度保守區位于序列上部。系統進化分析結果（圖2）顯示，SlGT-33（GenBank登錄號Solyc12g043090）與SlGT-17（GenBank登錄號Solyc-05g018350）聚類在同一分支上，二者氨基酸序列相似性最高，但僅為45.8%（表2），故推測SlGT-33蛋白具有特異性功能。

2. 2 SlGT-33基因組織表達特異性分析結果

由圖3可知，SlGT-33基因除了在莖和成熟葉中的相對表達量無顯著差異（P>0.05，下同）外，在其他組織中的相對表達量均存在顯著差異（P<0.05，下同）;以在莖和成熟葉中的相對表達量較高，顯著高于其他組織，其次是花和果實（綠色果實和紅色果實），在根部的表達量最低，即SlGT-33基因具有組織表達特異性，且主要在莖和成熟葉中發揮其調控功能。

2. 3 SlGT-33基因在外源植物激素處理和非生物脅迫下的表達分析結果

由圖4-A可知，經IAA、GA3和MeJA處理后，SlGT-33基因的相對表達量均與對照無顯著差異，說明這些植物激素對SlGT-33基因的相對表達無顯著影響;ACC處理4和24 h時SlGT-33基因的相對表達量較對照顯著降低，推測ACC抑制SlGT-33基因表達。SlGT-33基因經ABA處理2～24 h時其表達量均顯著高于對照，處理8 h時達最高值，說明SlGT-33基因表達受ABA誘導，可能是ABA響應基因。

由圖4-B可知，SlGT-33基因在高鹽脅迫和機械損傷下的相對表達量與對照無顯著差異，推測高鹽脅迫和機械損傷對SlGT-33基因表達無顯著影響;高溫脅迫和低溫脅迫下，SlGT-33基因的相對表達量整體上呈逐漸降低變化趨勢，尤其是低溫脅迫下，SlGT-33基因表達降幅較大，在脅迫36 h時降至脅迫0 h的13.2%，推測極端溫度抑制SlGT-33基因表達，尤其低溫脅迫抑制效果更明顯;在脫水脅迫下SlGT-33基因表達整體上呈逐漸升高的變化趨勢，脅迫4～36 h時，SlGT-33基因的相對表達量均顯著或極顯著（P<0.01）高于對照，表明脫水脅迫可誘導SlGT-33基因表達。綜上所述，SlGT-33基因屬于環境敏感型基因，特別是對極端溫度和脫水脅迫的響應最突出。

2. 4 SlGT-33-RNAi沉默株系鑒定結果

通過農桿菌介導轉化法獲得SlGT-33-RNAi沉默株系，利用qRT-PCR檢測各沉默株系中SlGT-33基因的表達情況（圖5），并與野生型進行比較，計算出沉默效率。結果顯示，6個SlGT-33-RNAi沉默株系的沉默效率為64%～83%，其中以RNAi-13株系的沉默效率最高，其次是RNAi-4和RNAi-5株系。但由于RNAi-13株系未結出果實和種子。因此，選取RNAi-4和RNAi-5株系作為后續研究對象。

2. 5 SlGT-33-RNAi沉默株系幼苗表型觀察結果

生長70 d的SlGT-33-RNAi沉默株系RNAi-4和RNAi-5幼苗株高均明顯低于野生型（圖6-A），雖然其復葉結構未發生改變，但整體尺寸明顯變小（圖6-B），且花序提前形成（圖6-C），說明相同時間內SlGT-33-RNAi沉默株系的生長較對照快。進一步分析發現，SlGT-33-RNAi沉默株系的株高和節間長度為野生型的60%左右，均極顯著低于野生型（圖7）。可見，抑制SlGT-33基因表達會導致番茄幼苗矮化，但加速了生殖生長。

2. 6 SlGT-33基因下游基因在SlGT-33-RNAi沉默株系莖尖中的表達情況

植株矮化與莖尖生長點發育有關，因此本研究以莖尖為材料，檢測SlGT-33基因下游基因的表達情況。由圖8-A可知，IPT2和PHAN基因在2個SlGT-33-RNAi沉默株系的相對表達量均顯著低于野生型，說明SlGT-33-RNAi株系矮化與IPT2和PHAN基因表達受抑制有關;KNOX2和WUS基因在SlGT-33-RNAi沉默株系的相對表達量顯著高于野生型，說明沉默株系矮化與KNOX2和WUS基因高效表達密切相關;而KNOX1基因的表達與野生型無顯著差異。由圖8-B可知，SlGT-33-RNAi沉默株系莖尖組織的CTK含量顯著低于野生型，說明抑制SlGT-33基因表達會導致CTK合成量減少，且抑制CTK關鍵合成酶基因IPT2和莖尖發育關鍵基因PHAN表達。

3 討論

3. 1 SlGT-33-RNAi沉默株系幼苗矮化

本研究PCR擴增獲得的SlGT-33基因ORF長度為1125 bp，編碼374個氨基酸殘基，與已知番茄品種1706的同源基因序列（XP004252336.1）（Yu et al.，2015）相比，在第61～63位少3個堿基，故少編碼1個氨基酸（谷氨酸），但并未影響蛋白保守區結構，可能屬于不同品種間的差異。通過qRT-PCR檢測發現，SlGT-33基因在莖和成熟葉中的表達量較高，推測該基因調控番茄植株高生長。本研究通過RNAi技術抑制SlGT-33基因表達從而得到矮化的番茄植株，進一步佐證上述SlGT-33基因調控植株高生長的推論。前人則通過其他途徑獲得矮化的番茄植株，如Bishop等（1996）通過細胞色素P450基因突變獲得番茄矮化株;Li等（2019）通過超表達MADS-box轉錄因子基因SlMBP9、Sun等（2020）通過抑制YABBY2b基因的表達分別實現番茄植株矮化;Tomlinson等（2019）通過阻止赤霉素途徑抑制因子DELLA蛋白的降解也獲得番茄矮化植株，但通過Trihelix家族SIP1亞家族基因獲得番茄矮化植株的報道還較少見。

3. 2 SlGT-33-RNAi沉默株系矮化與激素調控密切相關

本研究發現，SlGT-33基因表達可被外源ABA和脫水脅迫誘導，但受極端溫度抑制，故推測該基因為ABA響應基因。但大量研究證實，極端溫度與植物體內的ABA含量呈正相關（Toh et al.，2008;Bi et al.，2020），說明SlGT-33基因調控機制極其復雜。另外，ABA與CTK間存在拮抗作用（Zhai et al.，2020），ABA和CTK同時受抑制的分子機理尚未明確 （Nishiyama et al.，2011）。本研究發現， 在SlGT-33-RNAi沉默株系中SlGT-33基因表達受到抑制，導致CTK合成量同步減少，與上述研究結果存在差異。因此 SlGT-33作為轉錄因子，其調控網絡與調控機制還有待深入研究。

3. 3 SlGT-33-RNAi沉默株系矮化與莖尖組織相關

植株矮化通常與莖的頂端分生組織生長相關。頂端分生組織（SAM）由中心區（CZ）、外圍區（PZ）和髓狀分裂區（RM）3個功能區組成。通過調控SHOOT MERISTEMLESS（STM）基因的表達，可改變CZ區的細胞代謝（Yanai et al.，2005），進而改變莖尖發育。本研究中，STM基因的番茄同源基因KNOX2在SlGT-33-RNAi沉默株系莖尖組織中的相對表達量顯著高于野生型，且Jasinski等（2007）研究證實，STM基因超表達后可增加植株葉片的數量。因此，推測SlGT-33-RNAi沉默株系花序提前形成與葉片加快形成有關。而SlGT-33-RNAi沉默株系復葉變小的原因可能與PHAN基因表達受抑制有關，因為抑制PHAN基因表達會減小番茄葉片的尺寸（Zoulias et al.，2012）。另外，WUS基因在SlGT-33-RNAi沉默株系莖尖組織的相對表達量顯著高于野生型，推測SlGT-33-RNAi沉默株系頂端分生組織CZ區的生長受到干擾（Yadav et al.，2011）。在擬南芥中激活STM可促進CTK合成（Yanai et al.，2005），而本研究發現SlGT-33-RNAi沉默株系體內KNOX2基因表達上調，但CTK合成量減少， IPT2基因的表達也受到抑制，具體分子機理有待深入研究。

4 結論

SlGT-33基因屬于環境敏感型基因，其表達受ABA和脫水脅迫誘導，但受極端溫度的抑制。抑制SlGT-33基因表達會導致番茄植株矮化，其作用機制與頂端分生組織的CTK合成受抑制、莖尖組織關鍵調控基因KNOX2、PHAN和WUS的異常表達密切相關。

參考文獻：

崔寶祿，李紛芬，陳國平. 2020. 番茄復三螺旋基因響應外源激素和非生物脅迫的研究[J]. 西北植物學報，40（8）：1372-1379. doi：10.7606/j.issn.1000-4025.2020.08.1372.? [Cui B L，Li F F，Chen G P. 2020. Response of double trihelix genes to phytohormones and abiotic stress in tomato[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，40（8）：1372-1379.]

黃艷花，梁萍，石愛蓮. 2011. 植物生長延緩劑對兩種綠籬植物矮化效應研究[J]. 南方農業學報，42（3）： 284-287. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2011.03.013. [Huang Y H，Liang P，Shi A L. 2011. Effects of plant growth retardants on Hibiscus rosa-sinensis L. and Carmona micorphylla（Lam） G. Don[J]. Journal of Southern Agriculture，42（3）：284-287.]

Barr M S，Willmann M R，Jenik P D. 2012. Is there a role for trihelix transcription factors in embryo maturation？[J]. Plant Signaling & Behavior，7（2）：205-209. doi：10.4161/psb.18893.

Bi H H，Zhao Y，Li H H，Liu W X. 2020. Wheat heat shock factor TaHsfA6f increases ABA levels and enhances tole-rance to multiple abiotic stresses in transgenic plants[J]. International Journal of Molecular Sciences，21（9）：3121. doi：10.3390/ijms21093121.

Bishop G J，Harrison K，Jones J D. 1996. The tomato dwarf gene isolated by heterologous transposon tagging encodes the first member of a new cytochrome P450 family[J].? The Plant Cell，8（6）：959-969. doi：10.1105/tpc.8.6.959.

Breuer C，Kawamura A，Ichikawa T，Tominaga-Wada R，Wada T，Kondou Y，Muto S，Matsui M，Sugimoto K. 2009. The trihelix transcription factor GTL1 regulates ploidy-dependent cell growth in the Arabidopsis trichome[J]. The Plant Cell，21（8）：2307-2322. doi：10.1105/tpc.109.068387.

Brewer P B，Howles P A，Dorian K，Griffith M E，Ishida T，Kaplan-Levy R N，Kilinc A，Smyth D R. 2004. PETAL LOSS，a trihelix transcription factor gene，regulates pe-rianth architecture in the Arabidopsis flower[J]. Development，131（16）：4035-4045. doi：10.1242/dev.01279.

Fang Y J，Xie K B，Hou X，Hu H H，Xiong L Z. 2010. Systematic analysis of GT factor family of rice reveals a novel subfamily involved in stress responses[J]. Molecular Genetics and Genomics，283（2）：157-169. doi：10.1007/ s00438-009-0507-x.

Gao M J，Lydiate D J，Li X，Lui H，Gjetvaj B，Hegedus D D，Rozwadowski K. 2009. Repression of seed maturation genes by a trihelix transcriptional repressor in Arabidopsis seedlings[J]. The Plant Cell，21（1）：54-71. doi：10.1105/ tpc.108.061309.

Griffith M E，da Silva Conceicao A，Smyth D R. 1999. PETAL LOSS gene regulates initiation and orientation of se-cond whorl organs in the Arabidopsis flower[J]. Deve-lopment，126（24）：5635-5644. doi：10.1083/jcb.42.2.377

Jasinski S，Kaur H，Tattersall A，Tsiantis M. 2007. Negative regulation of KNOX expression in tomato leaves[J]. Planta，226（5）：1255-1263. doi：10.1007/s00425-007-0572-5.

Kaplan-Levy R N，Brewer P B，Quon T，Smyth D R. 2012. The trihelix family of transcription factors—light，stress and development[J]. Trends in Plant Science，17（3）：163-171. doi：10.1016/j.tplants.2011.12.002.

Kitakura S，Fujita T，Ueno Y，Terakura S，Wabiko H，Machida Y. 2002. The protein encoded by oncogene 6b from Agrobacterium tumefaciens interacts with a nuclear protein of tobacco[J]. The Plant Cell，14（2）：451-463. doi：10.1105/ tpc.010360.

Li A Z，Chen G P，Yu X H，Zhu Z G，Zhang L，Zhou S E，Hu Z. L. 2019. The tomato MADS-box gene SlMBP9 negatively regulates lateral root formation and apical dominance by reducing auxin biosynthesis and transport[J]. Plant Cell Reports，38（8）：951-963. doi：10.1007/s00299-019-02417-x.

Li X，Qin G，Chen Z，Gu H，Qu L J. 2008. A gain-of-function mutation of transcriptional factor PTL results in curly leaves，dwarfism and male sterility by affecting auxin homeostasis[J]. Plant Molecular Biology，66（3）：315-327. doi：10.1007/s11103-007-9272-6.

Liu X S，Wu D C，Shan T F，Xu S B，Qin R Y，Li H，Negm M，Wu D X，Li J. 2020. The trihelix transcription factor OsGTr-2 is involved adaption to salt stress in rice[J]. Plant Molecular Biology，103（4-5）：545-560. doi：10. 1007/ s11103-020-01010-1.

Nishiyama R，Watanabe A Y，Fujita A Y，Le D T，Kojima A M. 2011. Analysis of cytokinin mutants and regulation of cytokinin metabolic genes reveals important regulatory roles of cytokinins in drought，salt and abscisic acid responses，and abscisic acid biosynthesis[J]. The Plant Cell，23（6）：2169-2183. doi：10.1105/tpc.111.087395.

Pan Y，Seymour G B，Lu C，Hu Z，Chen X，Chen G. 2012. An ethylene response factor（ERF5） promoting adaptation to drought and salt tolerance in tomato[J]. Plant Cell Reports，31（2）：349-360. doi：10.1007/s00299-011-1170-3.

Sun M H，Li H，Li Y B，Xiang H Z，Liu Y D，He Y，Qi M F，Li T L. 2020. Tomato YABBY2b controls plant height through regulating indole-3-acetic acid-amido synthetase （GH3.8） expression[J]. Plant Science，297：110530. doi：10.1016/j.plantsci.2020.110530

Toh S，Imamura A，Watanabe A，Nakabayashi K，Okamoto M，Jikumaru Y，Hanada A， Ishiyama K，Tamura N， Kobayashi M， Yamaguchi S. 2008. High temperature-induced abscisic acid biosynthesis and its role in the inhibition of gibberellin action in Arabidopsis seeds[J]. Plant Physiology，146（3）：1368-1385. doi：10.1104/pp.107.113 738.

Tomlinson L，Yang Y，Emenecker R，Smoker M，Taylor J，Perkins S， Smith J， Maclean D， Jones J D. 2019. Using CRISPR/Cas9 genome editing in tomato to create a gibberellin-responsive dominant dwarf DELLA allele[J]. Plant Biotechnology Journal，17（1）：132-140. doi：10.1111/pbi. 12952.

Xu H Y，Shi X X，He L，Guo Y，Zang D D，Li H Y，Zhang W H， Wang Y C. 2018. Arabidopsis thaliana trihelix transcription factor AST1 mediates salt and osmotic stress tolerance by binding to a novel AGAG-Box and some GT motifs[J]. Plant & Cell Physiology，59（5）：946-965. doi：10.1093/pcp/pcy032.

Yadav R K，Perales M，Gruel J，Girke T，Jonsson H，Reddy G V. 2011. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex[J]. Genes Development，25（19）：2025-2030. doi：10.1101/gad.1725 8511.

Yanai O，Shani E，Dolezal K，Tarkowski P，Sablowski R，Sandberg G，Samach A，Ori N. 2005. Arabidopsis KNOXI proteins activate cytokinin biosynthesis[J]. Current Biology，15（17）：1566-1571. doi：10.1016/j.cub.2005.07.060.

Yu C Y，Cai X F，Ye Z B，Li H X. 2015. Genome-wide identification and expression profiling analysis of trihelix gene family in tomato[J]. Biochemical and Biophysical Re-search Communications，468（4）：653-659. doi：10.1016/j.bbrc.2015.11.010.

Zhai K H，Zhao G W，Jiang H Y，Sun C X，Ren J Y. 2020. Overexpression of maize ZmMYB59 gene plays a negative regulatory role in seed germination in Nicotiana tabacum and Oryza sativa[J]. Frontiers in Plant Science，（11）：564665. doi：10.3389/fpls.2020.564665.

Zhu M K，Chen G P，Zhang J L，Zhang Y J，Xie Q L，Zhao Z P，Pan Y，Hu Z L. 2014. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor SlNAC4 regulates salt and drought tolerance and stress-related genes in tomato（Solanum lycopersicum）[J]. Plant Cell Reports，33（11）：1851-1863. doi：10.1007/s00299-014-1662-z.

Zoulias N，Koenig D，Hamidi A，McCormick S，Kim M. 2012. A role for PHANTASTICA in medio-lateral regulation of adaxial domain development in tomato and tobacco leaves[J]. Annals of Botany，109（2）：407-418. doi：10. 1093/aob/mcr295.

（責任編輯 陳 燕）