凍融和凍融+蘇打鹽堿復(fù)合脅迫下苜蓿幼苗的生理響應(yīng)

李 紅， 李 波， 方志堅， 楊 曌， 張 超， 馮成龍， 金姍姍， 王思琦， 石婉瑩

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院， 黑龍江 齊齊哈爾161005； 2.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3.齊齊哈爾市園藝研究所， 黑龍江 齊齊哈爾， 161006)

我國東北地區(qū)存在大面積的以堿土為主的鹽堿地[1]，同時春秋兩季凍融頻繁發(fā)生，凍融和鹽堿復(fù)合環(huán)境脅迫對牧草的生長、生理特性的影響比單一脅迫更大[2-3]。近年來，對苜蓿(MedicagoSativaL.)耐鹽性和低溫的研究取得一定成果，苜蓿幼苗階段是其耐鹽堿和低溫能力較弱的時期，也是對苜蓿材料進(jìn)行耐鹽性和低溫篩選的關(guān)鍵時期。針對單鹽和混合鹽堿的生理生化研究表明，4種單鹽(NaCl，Na2SO4，NaHCO3和Na2CO3)對苜蓿脅迫下，隨著鹽濃度增加，幼苗的脯氨酸(Proline，Pro)、可溶性糖(Sduble sugar,SS)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量增加，堿性鹽脅迫各指標(biāo)變化大于中性鹽[5]；對NaCl/Na2CO3脅迫苜蓿幼苗抗氧化酶活性和MDA含量的研究可知，苜蓿葉片超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT))活性及MDA含量呈增加趨勢[5]。有關(guān)低溫對苜蓿生理影響的研究也取得了一定成果，在紫花苜蓿低溫脅迫生理特性研究中發(fā)現(xiàn)，SOD活性在4℃低溫12 h內(nèi)升高，24 h后下降，Pro含量隨低溫延長而增加，葉片電導(dǎo)率在溫度高于—3℃時增加緩慢，—4℃時顯著增加，說明苜蓿能夠耐受—3℃的低溫[6]。

目前，針對牧草的耐寒和耐鹽堿能力研究主要集中于單因素脅迫條件，有關(guān)凍融與鹽堿復(fù)合脅迫下牧草的響應(yīng)機制研究甚少。苜蓿幼苗在凍融和堿性鹽脅迫的生理反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在中度堿性鹽脅迫下，體內(nèi)活性氧、MDA含量和CAT，SOD活性升高，蛋白含量降低，整個凍融過程中，Pro和MDA含量、CAT和SOD活性呈先升后降[7]。在凍融和堿性鹽雙重脅迫下，苜蓿幼苗的損傷更大，關(guān)于苜蓿對凍融和鹽堿脅迫的響應(yīng)已受到廣泛關(guān)注，但溫度進(jìn)程和復(fù)合鹽堿濃度控制及對苜蓿生理代謝影響的綜合分析仍有待完善。

紫花苜蓿因其具有適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高、抗寒、抗旱、耐鹽堿、固氮能力強等特點，在國內(nèi)外廣泛種植，是全球范圍內(nèi)極具栽培價值的植物之一[8]，但低溫和鹽堿可嚴(yán)重制約著苜蓿產(chǎn)量和畜牧業(yè)的發(fā)展，因此對苜蓿幼苗進(jìn)行凍融鍛煉能有效提高苜蓿的抗寒性。本研究以‘龍牧807’苜蓿為材料，探究凍融及凍融+鹽堿復(fù)合脅迫對苜蓿幼苗生理生化的影響，為優(yōu)質(zhì)牧草選育及恢復(fù)寒性地區(qū)鹽漬化土壤奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以抗蘇打鹽堿能力較強的‘龍牧807’苜蓿(MedicagoSativaL.‘Longmu 807’)種子為試驗材料，該材料由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院所提供。

1.2 幼苗的培養(yǎng)

2019年5月15日將供試材料播種在土培育苗缽(高13 cm，下徑14 cm，上徑16 cm)中，培養(yǎng)基質(zhì)為黑土∶針葉土=5∶1，每缽均勻播種30粒種子，覆蓋1 cm厚培養(yǎng)基質(zhì)，在25℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每2 d供水一次。培養(yǎng)至 45 d后苗高 10～15 cm，可用于脅迫處理。

1.3 凍融脅迫處理

對培養(yǎng) 45 d后的幼苗進(jìn)行間苗處理，每個營養(yǎng)缽中保留 10 株長勢均勻的苜蓿幼苗，并進(jìn)行凍融脅迫處理，處理溫度融凍(T-F)試驗為每 2 h溫度降低5℃或3℃，同樣凍融(F-T)試驗為每2 h溫度升高5℃或3℃，整個循環(huán)試驗的溫度設(shè)計梯度為10℃(T-F10)，5℃(T-F5)，0℃(T-F0)，—3℃，0℃(F-T0)，5℃(F-T5)，10℃(F-T10)，每2 h對變溫冰箱的溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，3次重復(fù)，以常溫未脅迫處理的幼苗為對照(CK)，將凍融和融凍處理的幼苗葉片取下，置于—80℃冰箱中備用。

1.4 凍融+蘇打鹽堿脅迫處理

對培養(yǎng) 45 d后的苜蓿幼苗進(jìn)行間苗處理，每個營養(yǎng)缽中保留 10 株長勢均勻的幼苗，每個營養(yǎng)缽中澆灌150 mmol·L-1的混合蘇打鹽堿溶液100 mL(NaHCO3∶Na2CO3=9∶1)，處理 2 d，然后進(jìn)行同1.3凍融脅迫處理，每個處理3次重復(fù)，將凍融+蘇打鹽堿脅迫的幼苗葉片取下，置于-80℃冰箱中備用。

1.5 苜蓿幼苗葉片各指標(biāo)的測定方法

采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量；SS含量采用蒽酮比色法測定；Pro含量采用酸性茚三酮法[9]測定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定；CAT、抗壞血酸過氧化物酶(Aseorbate peroxidase，APX)活性采用分光光度法測定；SOD活性采用NBT光化還原法[11]測定；相對電導(dǎo)率(Relative conductivity，RC)采用電導(dǎo)法測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法[10]測定。

1.6 數(shù)據(jù)的處理與分析

灰色系統(tǒng)的建立：

(1)灰色系統(tǒng)的建立：將各抗逆指標(biāo)的平均隸屬值作為參考序列X0，可溶性糖等9項抗性指標(biāo)的平均值為比較序列(子序列)，記為Xi(i=1，2，…，9)。

(2)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理：由于各指標(biāo)的量綱不一致，需對原始數(shù)據(jù)作“初值化”處理，根據(jù)公式(1)將數(shù)據(jù)無量綱化：

(1)

式中Xi(k)為原始數(shù)據(jù)，Xi′(k)為無量綱化后的數(shù)據(jù)，X和Si分別為同一指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

(3)計算關(guān)聯(lián)系數(shù)及關(guān)聯(lián)度：根據(jù)公式(2)計算參考數(shù)列X0與比較數(shù)列Xi各對應(yīng)值的關(guān)聯(lián)系數(shù)：

(2)

式中i為某個指標(biāo)，ξi(k)為比較數(shù)列Xi對參考數(shù)列X0在第k點的關(guān)聯(lián)系數(shù)，p為分辨系數(shù)，p∈ (0,1]，本文分辨系數(shù)取p=0.5。

(4)根據(jù)關(guān)聯(lián)系數(shù)計算關(guān)聯(lián)度，公式為：

(3)

式中r0i為各序列關(guān)聯(lián)度，i=1，2……，9。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍融及凍融+鹽堿脅迫對苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)能力的影響

凍融處理下，苜蓿葉片中SS，Pro和SP含量在整個凍融循環(huán)(T-F10至F-T10)變化中呈先升后降的變化趨勢(圖1)，在-3℃低溫時3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量最高，SS，Pro和SP含量分別比CK高129.46%，329.63%和57.90%。-3，F(xiàn)-T0,F-T5與CK處理SS含量差異顯著(P<0.05)；凍融脅迫組Pro含量與CK處理差異顯著(P<0.05)；除T-F10脅迫組SP含量與CK處理差異不顯著外，其余各脅迫組與CK處理差異顯著(P<0.05)。凍融+鹽堿脅迫處理下，苜蓿葉片中的SS，Pro和SP含量在整個循環(huán)中呈先升后降的變化趨勢(圖1)。在-3℃+鹽堿脅迫組3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量最高，SS，Pro和SP含量分別比CK高289.56%，344.86%和97.34%。凍融+鹽堿脅迫下各脅迫組的3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均與CK差異顯著(P<0.05)。

圖1 凍融及凍融+鹽堿脅迫下苜蓿葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

對3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化進(jìn)行分析表明，凍融過程(F-T0至F-T10)中SS含量高于融凍過程(T-F10至T-F0)，凍融+鹽堿各脅迫組的SS，Pro和SP含量高于對應(yīng)凍融各脅迫組，SS含量分別為凍融各脅迫組的1.39，1.67，1.60，1.70，2.14，1.68和1.94倍，Pro含量分別為凍融各脅迫組的1.09，1.24，1.00，1.04，1.08，1.15和1.31倍，SP含量分別為凍融各脅迫組的1.40，1.42，1.45，1.25，1.43，1.39和1.24倍。凍融及凍融+鹽堿脅迫處理下，融凍過程中各脅迫組SS含量變化量較凍融過程大，說明3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化在脅迫初期更敏感。

2.2 凍融及凍融+鹽堿脅迫對苜蓿幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

2.2.1POD和SOD活性 凍融脅迫處理下，苜蓿葉片中POD和SOD活性在整個凍融循環(huán)中呈先升后降的變化趨勢(圖2A，B)，在—3℃低溫時POD和SOD活性最高，分別較CK增加了32.16%和101.87%(P<0.05)。整個凍融循環(huán)中，除F-T處理脅迫組的POD活性比CK低2.16%外，其余各脅迫組均比CK處理高。凍融+鹽堿脅迫處理下，苜蓿葉片中的中POD和SOD活性在整個循環(huán)中呈先升后降的變化趨勢(圖2A，B)，在—3℃+鹽堿脅迫組時達(dá)到最高值，分別較CK增加了34.86%和111.76%(P<0.05)。-3℃+鹽堿、F-T0+鹽堿脅迫組的POD活性與CK處理差異顯著(P<0.05)，凍融+鹽堿脅迫組的SOD活性均與CK處理差異顯著(P<0.05)。

對POD和SOD活性變化進(jìn)行分析表明，凍融過程中POD和SOD活性高于融凍過程，凍融+鹽堿各脅迫組的POD和SOD活性高于對應(yīng)凍融各脅迫組，凍融+鹽堿各脅迫組的POD活性分別為凍融各脅迫組POD活性的1.01，1.02，1.02，1.02，2.03，1.02和1.08倍，SOD活性分別為凍融各脅迫組SOD活性的1.04，1.04，1.03，1.05，1.01，1.01和1.03倍。

2.2.2CAT和APX活性 凍融脅迫處理下，CAT和APX活性在整個凍融循環(huán)變化過程中呈逐漸上升的變化趨勢(圖2C，D)，F(xiàn)-T10處理CAT和APX活性最高，分別較CK增加了262.38%和134.00%。除T-F10和T-F5處理外，凍融脅迫組CAT和APX活性與CK處理差異顯著(P < 0.05)。在凍融+鹽堿脅迫處理中，苜蓿葉片中CAT和APX活性整個循環(huán)中呈逐漸升高的變化趨勢(圖2C，D)，F(xiàn)-T10+鹽堿脅迫組CAT和APX活性最高，分別較CK增加了292.08%和184.00%。凍融+鹽堿脅迫下各脅迫組的CAT和APX活性均與CK處理差異顯著(P< 0.05)。

圖2 凍融及凍融+鹽堿脅迫下苜蓿葉片抗氧化酶活性的變化

對CAT和APX活性變化進(jìn)行分析表明，凍融+鹽堿脅迫下各脅迫組的CAT和APX活性均高于凍融循環(huán)各脅迫組，凍融+鹽堿各脅迫組CAT活性分別為凍融各脅迫組的2.04，2.04，1.10，1.09，1.08，1.04和1.08倍，APX活性分別為凍融各脅迫組的1.47，1.54，1.35，1.30，1.29，1.30和1.21倍。

2.3 凍融及凍融+鹽堿脅迫對苜蓿幼苗葉片膜透性物質(zhì)的影響

凍融脅迫處理下，苜蓿葉片中MDA含量在整個凍融循環(huán)中呈先升后降的變化趨勢(圖3A)，在F-T0脅迫組MDA含量最高，較CK增加了202.89%；RC在整個凍融循環(huán)中呈逐漸上升的變化趨勢(圖3B)，F(xiàn)-T10處理時RC最高，較CK增加了74.54%。凍融循環(huán)各脅迫組MDA和RC與CK處理差異顯著(P<0.05)。

圖3 凍融及凍融+鹽堿脅迫下苜蓿葉片膜透性物質(zhì)的變化

凍融+鹽堿脅迫處理下，苜蓿葉片中的MDA含量在整個循環(huán)中呈先升后降的變化趨勢，在F-T0+鹽堿脅迫時達(dá)到最高值，較CK增加了291.88%；RC在整個循環(huán)變化過程中呈逐漸上升的變化趨勢，在F-T10+鹽堿脅迫時達(dá)到最高值，較CK增加了82.93%。凍融+鹽堿各脅迫組MDA和RC與CK處理差異顯著(P<0.05)。

對MDA含量和RC變化進(jìn)行分析表明，凍融過程中MDA含量和RC高于融凍過程，凍融+鹽堿各脅迫組的MDA含量和RC高于對應(yīng)凍融各脅迫組，凍融+鹽堿各脅迫組的MDA含量分別為凍融各脅迫組MDA含量的1.78，1.50，1.13，1.22，1.29，1.08和1.00倍，凍融+鹽堿各脅迫組的RC分別為凍融各脅迫組的1.15，1.13，1.13，1.14，1.19，1.16和1.05倍。

2.4 凍融和凍融+鹽堿脅迫下苜蓿幼苗葉片各指標(biāo)隸屬函數(shù)分析

應(yīng)用隸屬法對凍融及凍融+鹽堿脅迫下各生理生化指標(biāo)進(jìn)行分析(表1)表明，凍融脅迫下各處理隸屬值由高到低依次為：—3℃>F-T0>F-T10> F-T5> T-F0>T-F5>T-F10>CK，凍融+鹽堿脅迫下各處理隸屬值由高到低依次為:-3℃+鹽堿>F-T0+鹽堿>F-T10+鹽堿>F-T5+鹽堿>T-F0+鹽堿>CK+鹽堿>T-F5+鹽堿>T-F10+鹽堿>CK。隸屬函數(shù)綜合評價值越大，表明該處理下苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累越多、抗氧化酶活性越高及對膜損傷越小。

表1 凍融及凍融+鹽堿脅迫下各指標(biāo)的隸屬值

2.5 灰色關(guān)聯(lián)度分析

關(guān)聯(lián)系數(shù)大小代表各指標(biāo)對該處理的敏感程度，對凍融及凍融+鹽堿脅迫下苜蓿幼苗葉片9項指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，根據(jù)不同脅迫下各指標(biāo)的測定值計算關(guān)聯(lián)度(表2)。結(jié)果表明，凍融脅迫下，SS，Pro，SOD和CAT具有較大的關(guān)聯(lián)系數(shù)，而SP關(guān)聯(lián)系數(shù)最小，說明SS，Pro，SOD和CAT指標(biāo)對凍融脅迫最敏感，其余指標(biāo)敏感度較低。凍融+鹽堿脅迫下，Pro，SOD和SP指標(biāo)關(guān)聯(lián)系數(shù)較大，而RC關(guān)聯(lián)系數(shù)最小，說明Pro，SOD和SP指標(biāo)對凍融+鹽堿脅迫最敏感。綜合分析表明，各指標(biāo)與凍融和鹽堿脅迫的關(guān)聯(lián)度由高到低依次為：Pro>SOD>CAT>SS>APX>SP>MDA>POD>RC。

表2 不同脅迫處理下各指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度

3 討論

凍融和混合鹽堿脅迫是限制植株生長發(fā)育的重要因素，凍融脅迫引起植物細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，植株無法利用結(jié)冰的水分，導(dǎo)致植物體內(nèi)水分短缺；混合鹽堿脅迫下，植株生存環(huán)境中的鹽離子含量較高，外環(huán)境滲透壓升高，導(dǎo)致植物體滲透失水[11-12]。本研究在凍融及凍融+鹽堿脅迫下，整個凍融循環(huán)變化過程中Pro，SS和SP含量等均呈先增后降變化趨勢，在—3℃低溫脅迫時各滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量最高，凍融和鹽堿雙重因子脅迫下3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量明顯高于單因子脅迫，說明凍融條件下的鹽堿環(huán)境對苜蓿幼苗的傷害更大。這是因為在雙重脅迫下，苜蓿不僅要通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)其滲透能力，還要抵抗低溫傷害，使生長受到抑制。本研究結(jié)果與鞏澤等[13]研究黑麥草(LoliumperenneL.)幼苗在凍融及NaHCO3復(fù)合脅迫下的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化結(jié)果一致。植物在遭受凍融和鹽堿等脅迫時，體內(nèi)積累了大量Pro，SS和SP等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以降低凍融和鹽堿對植物造成傷害，其積累指數(shù)與植物抗逆性密切相關(guān)。

逆境脅迫下，植物細(xì)胞膜損傷和通透性加大，導(dǎo)致電解質(zhì)外泄，膜質(zhì)過氧化增加，產(chǎn)生大量MDA[14-15]。本試驗結(jié)果表明，凍融及凍融+鹽堿脅迫下，整個凍融循環(huán)變化過程中RC呈逐漸增加的變化趨勢，且凍融過程RC的變化幅度較融凍過程低，而MDA含量在整個凍融循環(huán)變化過程中呈先增后降的變化趨勢，說明在凍到融過程中，隨著溫度回升，電解質(zhì)滲透量減小，植物體通過自我調(diào)節(jié)機制進(jìn)行質(zhì)膜修復(fù)，增強質(zhì)膜的選擇透性，降低膜質(zhì)過氧化程度，導(dǎo)致MDA含量下降。而凍融+蘇打鹽堿雙重脅迫，植物所受到的膜損傷和膜質(zhì)過氧化和增加，導(dǎo)致該循環(huán)變化過程中RC和MDA含量高于對應(yīng)凍融單因子脅迫，本研究結(jié)果與李晨等[16]人研究黑麥草幼苗對凍融及酸沉降的生理響應(yīng)特征時得到結(jié)論相似。MDA含量和RC的變化反映了逆境對植物的傷害程度，在凍融和鹽堿逆境脅迫時，通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可減少膜脂過氧化和膜的損傷。

植物體正常生長環(huán)境中，活性氧(ROS)的產(chǎn)生和清除速率保持動態(tài)平衡，逆境脅迫下，ROS的產(chǎn)生速率增加，植物體可激活體內(nèi)的抗氧化酶(POD，SOD，CAT，APX)活性來清除過量的ROS，以抵御逆境脅迫帶來傷害[17-19]。本研究中，凍融及凍融+鹽堿脅迫下，POD和SOD活性在整個凍融循環(huán)變化過程中均呈先增后降的趨勢，CAT和APX活性在整個凍融循環(huán)變化過程中則呈逐漸增加的趨勢，凍融和鹽堿雙因子共同脅迫，導(dǎo)致苜蓿葉片的抗氧化酶活性均高于單因子脅迫，研究結(jié)果與何訪淋等[20]人研究醋酸鈣鎂鹽環(huán)保融雪劑及凍融脅迫對高羊茅幼苗的生理影響,朱悅等[22]人研究白三葉葉片對酸沉降及凍融脅迫的生理響應(yīng)特征的研究結(jié)果一致。在逆境條件脅迫下，植物通過提高抗氧化酶系統(tǒng)的活性來清除過量ROS,以抵抗凍融及鹽堿脅迫導(dǎo)致的植物機體損傷。

苜蓿對凍融和凍融+鹽堿脅迫的生理生化變化過程是一種綜合反應(yīng)，苜蓿對鹽脅迫和凍融脅迫表現(xiàn)出一定的抗性，對紫花苜蓿寒冷地區(qū)鹽堿的確切機理有待進(jìn)一步研究。本試驗僅從生理生化指標(biāo)方面探討了其對苗期苜蓿的影響，應(yīng)進(jìn)一步探討這種復(fù)合脅迫對苜蓿形態(tài)結(jié)構(gòu)和基因差異表達(dá)的影響。

4 結(jié)論

苜蓿幼苗在凍融循環(huán)和凍融循環(huán)+蘇打鹽堿脅迫下，通過提高抗氧化酶活性與增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，可緩解脅迫導(dǎo)致的傷害。隸屬函數(shù)法對凍融循環(huán)、凍融循環(huán)和蘇打鹽堿脅迫下9項生理生化指標(biāo)變化分析，凍融循環(huán)脅迫下隸屬值由高到低依次為—3℃>F-T0>F-T10> F-T5> T-F0>T-F5>T-F10> CK；凍融循環(huán)+鹽堿脅迫下隸屬值由高到低依次為—3℃+鹽堿>F-T0+鹽堿>F-T10+鹽堿>F-T5+鹽堿>T-F0+鹽堿>CK+鹽堿>T-F5+鹽堿>T-F10+鹽堿>CK；凍融循環(huán)和凍融循環(huán)+鹽堿脅迫與各指標(biāo)綜合關(guān)聯(lián)度由高到低依次為Pro>SOD>CAT>SS>APX>SP>MDA>POD>RC。