富氫水對草地早熟禾耐鹽性的影響以及與抗氧化酶活性的關系

張韋鈺， 王春勇， 杜紅梅

(上海交通大學設計學院， 上海 200240)

草地早熟禾(Poapratensis)是禾本科早熟禾屬多年生草本植物，喜歡濕潤冷涼的氣候，具有較強的抗寒能力，廣泛地分布于我國東北、華北、西北以及西南等地[6-7]。不同草地早熟禾品種的耐鹽性不同，‘Midnight II’是一個坪用性狀好，耐熱性強的草地早熟禾品種，適宜在我國華東地區栽培，但是耐鹽性較差[8]。我國江淮一帶有比較大的沿海灘涂面積，分析鹽脅迫對草地早熟禾的影響，采用一定的措施提高草地早熟禾品種的耐鹽性，并分析其機理對于草地早熟禾的推廣具有重要意義。

氫氣(H2)是宇宙中最輕、最充分的元素，一直以來被認為是一種惰性氣體。但是近年來的研究表明，H2具有重要的生物學功能，可以提高植物對非生物脅迫的抗性[9]。現有的研究表明，H2可以提高擬南芥(Arabidopsisthaliana)[10]，甘薯(Dioscoreaesculenta)[11],水稻(Oryzasativa)[12-13],小白菜(Brassicacampestris)[14],玉米(Zeamays)幼苗[15]和黃瓜(Cucumissativus)幼苗[16]的耐鹽性。H2提高植物的抗鹽性和植物抗氧化能力的提高有關。趙蘋藝等的研究表明，H2提高甘薯幼苗的抗鹽性主要和幼苗中相對含水量(Relative water content,RWC)的增加和抗氧化能力的提高有關[11]；田婧蕓等證明了富氫水(Hydrogen-rich water,HRW)通過避免鹽脅迫下玉米幼苗的氧化應激及重建活性氧穩態來提高其耐鹽性[15]；Xu等也證明了H2增強水稻幼苗的耐鹽性和ROS代謝及其相關基因的表達有關[13]。在以往對草地早熟禾耐鹽性影響的研究，多集中于不同品種耐鹽性的評價[17]、轉基因植株的研究[18]、外源添加物質[19-20]以及生長調節劑[21]對草地早熟禾耐鹽性的影響等方面，而有關外源H2對草地早熟禾的耐鹽性及相關機制的影響的研究尚未見報道。本研究在前期工作的基礎上，在采用200 mM NaCl脅迫處理處理前以及脅迫處理前期，分別使用HRW對草地早熟禾進行葉片噴施和灌根處理。通過比較非鹽處理以及鹽處理條件下，HRW對草地早熟禾葉片中相關生理指標以及抗氧化酶相關基因表達等的影響，分析HRW對草地早熟禾耐鹽性的影響，并從抗氧化脅迫的角度，初步闡述HRW處理影響草地早熟禾耐鹽性的可能機制，本研究結果對草地早熟禾耐鹽性的提高，以及氫農業的發展具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本次試驗草種為從北京克勞沃種子公司購買的進口草地早熟禾品種‘Midnight II’。草種凈度為98%，發芽率為95%。

1.2 方法

1.2.1富氫水的制備 參考Cui等的方法[22]，將使用SHC-300型氫氣發生器(濟南浩偉儀器有限公司)制得的純凈氫氣(99.99%，v/v)以150 mL·min-1的速率通入1 L的去離子水中1 h，制得濃度為1.20 ppm的HRW。然后立即用去離子水進行稀釋，制得體積濃度為50%的HRW。HRW濃度使用ENH-100便攜式測氫儀(Trustlex Co.,Led,Japan)測定。

1.2.2試驗處理 挑選大小一致，顆粒飽滿的草地早熟禾種子，5%的次氯酸鈉消毒15 min后，均勻地播種于4×8的穴盤中，每穴播種10粒種子，待穴盤種子萌發第二片葉后開始添加1/4的Hoagland’s營養液，35 d后開始進行HRW處理。分為4種處理，分別是處理I：對照(Control，去離子水)，即只進行去離子水的澆灌，不添加HRW與NaCl處理；處理II：50% HRW (去離子水+50% HRW)，使用50%的HRW對草地早熟禾進行葉片噴施和灌根，保證葉片的正反兩面均勻噴施，灌根時充分灌溉，以有水從穴盤底部流出為準，平均每株的施用量為大約10 mL，連續處理2 d，每天處理1次；處理III：200 mM NaCl，為了防止產生“鹽激”，NaCl濃度每天增加50 mM，至第4 d，達到200 mM；處理IV：200 mM NaCl+50% HRW，HRW在添加NaCl前2 d和前1 d各添加1次，添加NaCl 4 d后添加1次，添加方法同處理II及處理III。每個處理重復4次，每個處理16孔。鹽脅迫處理的0 d，5 d，15 d和20 d取樣進行鹽脅迫指標和活性氧代謝相關指標分析。

4個組同時在人工氣候室內進行培養，氣候室內溫度(23±2)℃/(18±2)℃(晝溫/夜溫)，相對濕度60%～80%，光周期10 h，光合有效輻射510 μmol·m-2·s-1。

1.2.4qRT-PCR 參照天根生化科技公司的RNAprep pure Plant Kit試劑盒進行草地早熟禾總RNA的提取，然后依照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，以合成的cDNA為模板，以Actin作為內參基因，對草地早熟禾APX1，MR，CAT2基因進行擴增qRT-PCR按照TaKaRa公司的TB Green?Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)試劑盒進行。參考轉錄組測序結果進行引物設計，引物序列詳見表1。

表1 草地早熟禾抗氧化酶相關基因引物

1.3 數據分析

應用SPSS 22.0軟件，在P<0.05的水平，采用Fisher’s最小顯著差異法，分析HRW對鹽脅迫條件下草地早熟禾耐鹽相關生理指標、ROS積累、抗氧化酶活性以及抗氧化酶相關基因表達的影響。圖采用SigmaPlot 13.0軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 富氫水處理對草地早熟禾抗鹽相關生理指標的影響

鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片的DMC(P<0.05)。而50%的HRW處理抑制了鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片的DMC積累，尤其是在長時間鹽脅迫條件下。在第5 d，10 d，15 d和20 d鹽脅迫條件下，添加50%的HRW處理后，草地早熟禾葉片的DMC分別下降了4.50%，5.30%，17.02%和28.42%(圖1-A)。

5 d～20 d的鹽脅迫均顯著降低了草地早熟禾葉片的RWC (P<0.05)。添加HRW抑制了鹽脅迫導致的草地早熟禾葉片失水。與不添加HRW的鹽脅迫處理相比，添加HRW處理10 d，15 d和20 d，草地早熟禾葉片的RWC分別增加了14.17%，35.54%和84.98%。而不加鹽的條件下，添加HRW對草地早熟禾葉片的RWC沒有顯著影響(圖1-B)。

圖1 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片干物質含量(A)、相對含水量(B)的影響

與對照組相比，5 d和10 d鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片葉綠素含量無顯著變化，第15 d和第20 d顯著下降(P<0.05)。添加HRW延緩了由于鹽脅迫處理導致的草地早熟禾葉片的葉綠素降解。第15 d和20 d鹽脅迫條件下添加50%的HRW，草地早熟禾葉片中葉綠素含量顯著增加(P<0.05)，分別提高了49.32%和65.20%(圖2)。

圖2 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片葉綠素含量的影響

鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片的EL值(P<0.05)。與對照組相比，隨著鹽害程度的加深，草地早熟禾葉片的EL值逐漸增加(圖3)。50%的HRW處理顯著降低了鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片的EL值增加。在鹽處理的第5 d，10 d，15 d和20 d，添加50%HRW后，EL值分別下降了16.55%，18.24%，33.73%和25.08%。

圖3 50%富氫水處理對200 mM NaCl處理條件下草地早熟禾葉片電解質外滲的影響

2.2 富氫水處理對鹽脅迫下草地早熟禾活性氧代謝的影響

圖4 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片超氧陰離子(A)和過氧化氫(B)含量的影響

MDA含量是衡量脅迫條件下植物細胞膜脂過氧化程度的重要指標。草地早熟禾葉片內的MDA含量隨著鹽脅迫時間的延長而增加，在鹽脅迫的第5 d和20 d，相較于對照組，MDA含量分別增加了34.74%和122.51%；而外源添加HRW則顯著降低了鹽脅迫條件下草地早熟禾體內MDA的積累(P<0.05)，相較于NaCl處理組，在第5 d和第20 d，HRW+NaCl組中草地早熟禾體內的MDA含量分別降低了23.85%和26.22%(圖5)。

圖5 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片丙二醛含量的影響

鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片SOD活性(P<0.05)。而長時間鹽脅迫條件下，添加HRW則顯著降低了草地早熟禾葉片中SOD的活性(P<0.05) (圖6-A)。鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片POD活性(P<0.05) (圖6-B)。而外源添加50%濃度HRW，顯著抑制了草地早熟禾葉片中POD活性的增加，與不添加HRW處理的鹽處理相比，第5 d和20 d，POD活性分別降低了22.02%和23.30%。短時間的鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片CAT活性，而長時間的鹽脅迫顯著降低了草地早熟禾葉片CAT活性(P<0.05)。外源添加HRW抑制了長時間鹽脅迫下CAT活性的降低，與NaCl處理組相比，HRW+NaCl處理組中的CAT活性提高了36.51%(P<0.05) (圖6-C)。

圖6 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片超氧化物歧化酶(A)、過氧化物酶(B)和過氧化氫酶(C)活性的影響

鹽脅迫處理5 d沒有顯著影響草地早熟禾葉片APX活性。鹽脅迫處理20 d后，APX活性顯著下降(P<0.05)。外源添加HRW顯著增加了20 d鹽脅迫下草地早熟禾葉片中APX活性(圖7-A)。5 d和20 d的鹽脅迫顯著增加了草地早熟禾葉片的GR活性，尤其是在20 d鹽脅迫下。外源添加HRW顯著降低了20 d鹽脅迫下草地早熟禾葉片中GR的活性(圖7-B)。5 d和20 d的鹽脅迫顯著降低了草地早熟禾葉片的DR活性。外源添加HRW顯著提高了鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片中DR的活性，相較于鹽脅迫組，DR活性分別提高34.12%和58.22%(如圖7-C)。5 d鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片中的MR活性顯著增加，而20 d鹽脅迫條件下，草地早熟禾葉片中MR活性顯著下降。添加HRW抑制了鹽脅迫對草地早熟禾葉片MR活性的影響，20 d時差異達顯著水平(P<0.05)，相較于NaCl處理組，HRW+NaCl處理組葉片中MR活性提高了52.93%(圖7-D)。

圖7 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片抗壞血酸過氧化物酶(A)、谷胱甘肽還原酶(B)、脫氫抗壞血酸還原酶(C)和單脫氫抗壞血酸還原酶(D)活性的影響

以草地早熟禾不添加NaCl和HRW對照條件下的基因表達量為1，對比其在5 d和20 d，50% HRW處理、200 mM NaCl處理以及200 mM NaCl+50%HRW處理條件下的抗氧化酶基因表達量，以此來分析HRW對鹽脅迫條件下草地早熟禾抗氧化酶相關基因表達的影響。在5 d和20 d鹽脅迫條件下，與對照相比，草地早熟禾葉片內3個抗氧化酶基因CAT2，APX1和MR均上調表達，外源施加50% HRW不同程度的降低了鹽脅迫條件下相關基因的表達量(圖8)。在鹽脅迫的第5 d和20 d，草地早熟禾葉片中CAT2，APX1和MR的相對表達量分別是對照組的1.67倍和1.71倍，1.48倍和2.54倍以及2.38倍和1.79倍；而外源添加50%的HRW分別使鹽脅迫下CAT2，APX1和MR的相對表達量降低了27.53%和24.56%，40.6%和35.21%以及21.73%和31.17%。

圖8 50%富氫水處理對鹽脅迫條件下草地早熟禾葉片CAT2 (A)，APX1 (B)和MR (C)相對表達量的影響

3 討論與結論

采用一定的措施提高草坪草的耐鹽性，并分析其相關機制，是草坪草應用和新品種選育過程中的難點。鹽害影響植物的光合作用以及水分的吸收和利用[30]。草地早熟禾在鹽脅迫，尤其是長時間鹽脅迫條件下葉片的RWC含量下降，DMC含量增加，外源添加HRW處理后，鹽脅迫下草地早熟禾葉片RWC含量上升，DMC含量下降，這可能是由于草地早熟禾在鹽脅迫下，細胞失水導致RWC含量下降，DMC含量上升，而添加HRW降低了細胞的失水率，提高了細胞的RWC，也在一定程度上導致了DMC含量下降現象的發生。

鹽脅迫條件下葉片衰老的重要原因是葉綠素含量下降[31]，葉綠素含量的高低與葉片的光合能力密切相關。鹽脅迫條件下添加HRW，尤其是在15 d和20 d鹽脅迫條件下，與NaCl處理組相比，HRW+NaCl處理組的葉綠素含量維持在較高水平，這說明HRW能夠有效維持鹽脅迫下草地早熟禾體內的葉綠素含量，維持植物光合作用的正常進行。細胞失水會引起細胞內膨壓和滲透勢的改變，造成電解質外滲率的增加[32]。植物在鹽脅迫條件下會發生膜透性增強和膜脂過氧化現象。作為膜脂過氧化的產物，MDA會損害細胞生物膜并抑制保護酶的活性[33]。在本研究中，鹽脅迫條件下，草地早熟禾葉片EL值上升，MDA含量增加，外源添加HRW降低了鹽脅迫下葉片的EL，減少了葉片MDA的積累，這說明外源添加HRW降低了鹽脅迫條件下草地早熟禾細胞膜的損傷。

高濃度的ROS對植物的生長是有害的。鹽脅迫條件下，光合作用受到抑制，ROS的合成增加，植物體內的氧化還原過程失衡，引起氧化損傷，破壞植物體內的生物大分子[36]。此時，抗氧化酶活性提高，用于清除過量的ROS[31],和Puyang等的研究一致，在一定時間鹽脅迫條件下，草地早熟禾ROS清除酶活性增加[34]。與鹽處理的對照相比，HRW處理后ROS積累量顯著下降，因此相關ROS清除酶的活性也顯著低于僅用鹽處理的植株。另外，和Xu等[13]在水稻鹽脅迫以及Cui等[22]在苜蓿(Medicagosativa)鎘脅迫中的發現一樣，也發現了重度鹽脅迫條件下，草地早熟禾中部分抗氧化酶，包括CAT，APX，DR和MR活性顯著下降，而在HRW處理條件下，這些抗氧化酶的活性顯著增加，從而有效降低鹽脅迫損傷，減少細胞的過氧化程度，保護細胞膜的完整性。

植物鹽脅迫條件下，通過相關酶基因的表達，誘導抗氧化酶蛋白的表達，從而使植物表現出一定的抗鹽能力。在本研究中，在鹽脅迫條件下，與0 d以及5 d和20 d非鹽脅迫的對照相比，草地早熟禾抗氧化酶基因CAT2，APX1和MR都上調表達，可能是植物對于ROS積累的一種響應。Xie等[10]在鹽處理5 d的擬南芥植株中發現了H2阻遏了由鹽脅迫導致的cAPX1的下調表達，而Xu等[13]的研究也發現，水稻鹽處理3 d，添加HRW有利于APXb和CATB基因的上調表達，提高相關抗氧化酶的活性，緩解水稻的鹽脅迫。與前人的研究不同的是，添加HRW后，草地早熟禾3個抗氧化酶基因CAT2，APX1和MR的表達量都顯著的低于鹽脅迫處理，這一方面可能是由于受脅迫強度的影響，另一方面是由于添加HRW處理后，ROS含量顯著下降，反饋調控了抗氧化酶基因的上調表達。

基于以上分析，并結合鹽脅迫下草地早熟禾的各項生理指標可知，50% HRW處理能夠有效提高草地早熟禾的耐鹽性，緩解鹽脅迫帶來的氧化損傷，基于此推測在植物逆境脅迫中，HRW可能有直接清除ROS的能力，而這一觀點已經在動物試驗中得到了證實。Ohsawa等[37]以及Ohta[38]的研究均表明，H2可以選擇性的清除生物體內的過量自由基，同時不會與其它必要的ROS發生反應，從而發揮其抗氧化的作用。此外，在體外試驗中，也進一步證實了HRW有直接淬滅H2O2的作用[10]。與沈文飚等[9]的推測一樣，本研究認為在H2調控草地早熟禾鹽脅迫過程中，ROS的含量變化可能發揮關鍵作用。外源H2添加的情況下，草地早熟禾鹽脅迫下ROS的重要作用可以總結為圖9。

圖9 活性氧在外源H2調控草地早熟禾耐鹽性中的重要作用

綜上所述，外源添加HRW顯著提高草地早熟禾的耐鹽性，可能與HRW通過降低ROS積累，維持細胞膜的穩定性，避免氧化應激，重構活性氧穩態，提高細胞的抗氧化能力有關。