植物根際促生菌菌肥在高寒草甸替代化肥效應研究

張萬通, 李超群, 于 露, 邵新慶

(中國農業大學草業科學與技術學院， 北京 100193)

青藏高原作為我國重要的生態屏障之一，擁有豐富的高寒草地資源，形成了特有的高寒草甸生態系統[1]。獨有的嚴酷自然地理環境造就了生態系統的極端脆弱性，在區域性和持久性的自然因素和人為因素的干擾下，極易造成草地退化甚至荒漠化，導致高寒草甸生態環境日益惡化[2]。施肥作為退化草地改良和維持天然草地可持續利用的有效手段[3-4]，能增加土壤中營養元素含量，提供植物生長的必需養分，對高寒草地生態系統群落多樣性、土壤養分、草地生產力等多方面均能產生影響[5]。

傳統意義的施肥雖對農業的發展起到關鍵作用，但近年來施用化肥的負面效應逐漸顯現，如施肥結構不合理、重視氮磷肥卻忽視了鉀肥的使用；過分注重底肥，施過底肥后不再追肥等均導致了水土失衡、土壤板結等現象[6]。同樣在草地施肥中也存在一些問題，如肥料利用率低，無機肥和有機肥不能合理配施，忽視菌肥的使用等，均會造成肥料浪費和土壤營養單一化等問題[7]。

PGPR作為土壤中天然存在的具有生物防治活性的一類細菌，能夠間接或直接促進作物生長，主要分布在植物根際(根際土壤、根表面、根內部)[8]。它們定殖在植物根系內與植物形成共生關系，驅動著土壤生態系統中物質循環和能量流動過程，不僅可以合成能夠影響植物生長發育的物質(如生長素等植物激素)，活化并增加土壤中有效元素的含量(如氮、磷、鉀)[9]促進植物對養分的吸收，亦能減輕或抑制植物病害的發生來促進植物生長[10-11]。研究表明PGPR具有提高宿主植物養分利用率的功能，如生物固氮和有機磷化合物的礦化等[12]。常見的根際促生菌有假單孢菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、農桿菌屬(Agrobacterium)、埃文氏菌屬(Eriwinia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、巴斯德氏菌屬(Pasteuria)、沙雷氏菌屬(Serratia)、腸桿菌屬(Enterobacter)等[13]。PGPR菌肥(或生物菌肥)的研究多集中在對藍莓(Vacciniumspp.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)等經濟作物以及羊草(Leymuschinensis)、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)等牧草的影響[14-17]，然而對草地生態系統(群落)的相關研究較少。

目前研究表明PGPR生物菌肥配施部分化肥，可在數量和性能上與化肥很好地相互補充，在農業生產中減少無機化肥的過度使用，以此達到綠色生產、保障食品安全的目的[18]。因此，為了減少青藏高原高寒草甸化肥的使用，以及降低化肥對青藏高原高寒草甸的污染程度，本試驗擬施用不同劑量的化肥和PGPR菌肥，開展地上植被和土壤理化性質的研究，以期了解PGPR菌肥替代部分化肥的可能性，為高寒氣候條件下肥料的合理使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不同禾本科植物根際篩選獲得的供試PGPR復合菌肥，其主要成分為高效溶磷菌(Bacillussp.)、聯合固氮菌株(Azospirillussp.)、分泌植物激素菌(Azospirillussp.)和生防菌株(Bacillussp.)(專利號ZL 2010 10557699.3)，由甘肅農業大學草業學院提供。有機肥來自于試驗園區，主要成分為腐熟羊糞(有機質32.39%，氮約為1.63%，磷(P2O5)1.54%，鉀(K2O)0.085%)；磷肥主要成分為過磷酸鈣(14% P2O5)，來源于云南省昆明市海口宏寶磷肥廠；氮肥主要為尿素(N 46%)，由青海云天化國際化肥有限公司提供；氮磷肥則為磷酸氫二銨(N 18%，P2O546%)，由湖北大峪口化工有限責任公司提供。

1.2 試驗設計

試驗地位于青海省海北州海晏縣高原現代生態畜牧試驗示范園牧草種植試驗區(100°23'～101°20'E，36°44'～37°39'N)。屬高原亞干旱氣候，年平均氣溫1.5℃左右，年日照時數大約在2 980 h，年降水量大約400 mm，無絕對無霜期。主要植被類型有高寒草甸、高寒草原、高寒流石坡稀疏植被。選取植被類型相對一致的兩塊樣地，分別施用化肥和PGPR菌肥。同時對試驗地進行圍欄處理，化肥、有機肥和菌肥試驗均采取隨機區組設計。小區設計如下：每個小區面積為10 m×6 m，各小區間隔1 m，區間不施肥[19]。于2014年7月和2015年6月2次將肥料施在試驗小區，其中PGPR菌肥施用是用一定量的土和菌肥混合均勻，開溝條施于行間，深度3～5 cm，且施后立即覆土。2塊樣地施肥后不采取任何人工措施，讓其自然生長，每個處理設置5個重復。試驗中各處理肥料施用量詳見表1。

表1 化肥施用量

1.3 測定指標及方法

1.3.1植物群落調查 在2015年8月12日調查群落結構及物種組成，此時植物群落生物量達到高峰期，便于區分鑒別植物物種。在每個小區內選取一個50 cm×50 cm的樣方，以調查樣方內的植物群落特征，即物種的數量、密度、總蓋度、植物高度等。Margalef豐富度指數(Ma)、Shannon-Wiener多樣性指數(H＇)衡量地上植物群落的多樣性，Pielou均勻度指數(J)來表示植物群落的均一性。植被調查結束后，齊地面刈割樣方內所有的植物，裝在紙信封后帶回實驗室于65℃的烘箱中烘至恒重，稱重計算地上生物量。

1.3.2土壤理化性質 在每個小區用直徑5 cm×5 cm土鉆隨機取地表0～20 cm的土壤，按之字形進行5次重復取樣，將其混勻后作為該小區的一個樣品，過2 mm篩挑出植物殘體和碎石塊。然后將每份樣品分為2份：一份自然風干，用來分析土壤理化性質；另一份放在裝有冰塊的保溫箱內，盡快帶回實驗室，采用烘干稱重法測定土壤含水量；用pH計和電導率儀分別測定土壤pH和電導率EC。土壤全氮、全磷、有機碳分別用凱式定氮法、鉬銻抗比色法測定、濃硫酸-重鉻酸鉀稀釋熱法測定，土壤無機氮測定采用流動分析儀分析[20]。

1.4 數據分析與處理

物種多樣性選用Shannon-wiener多樣性指數(H＇)、Pielou均勻度指數(J)和Margalef豐富度指數(Ma)等進行測量。

(1)

Pielou均勻度指數：J=H＇/lnS

(2)

Margalef豐富度指數：Ma=(S-1)/lnN

(3)

式中：Pi為物種i在群落中的重要值，即(相對密度+相對高度+相對生物量)/3；S為物種數；N為樣方中總物種個體數。

用Microsoft Excel2010整理、計算數據并用origin作圖，對不同施肥處理下地上生物量、Shannon-wiener多樣性指數、Pielou均勻度指數、Margalef物種豐富度指數、土壤水分、土壤pH值、土壤電導率、土壤全氮、土壤全磷、土壤有機碳、土壤銨態氮、土壤硝態氮含量進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，使用LSD法進行多重比較，顯著性水平為P<0.05。以上所有數據用SPSS 17.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對植物群落特征的影響

2.1.1不同施肥處理對地上生物量的影響 NP處理較CK處理顯著增加地上生物量，增幅為72.19%(圖1)。N處理、O處理、J1+N處理和J1處理分別使地上生物量平均增加28.9%，4.05%，20.54%，6.69%，但無顯著性差異。P處理、J1+P處理、J3處理與CK 267.49 g·m-2相比，分別使地上生物量下降至254.25 g·m-2，238.42 g·m-2，260.71 g·m-2，且差異不顯著。

圖1 不同施肥處理下地上生物量情況

2.1.2不同施肥處理對物種多樣性的影響 CK處理的物種豐富度為17.0，其它施肥處理與CK相比均降低了物種豐富度，NP處理下降至13.20，降幅約為22.35%，差異顯著(P<0.05)；J1+N處理和J2處理效果相同，均使物種豐富度下降至15，但處理間差異不顯著。不同施肥處理均導致Shannon-wiener多樣性指數呈現下降趨勢，NP處理和J1+N處理分別下降至2.33和2.38，僅O處理下降最少為2.4。Pielou均勻度指數在不同施肥處理下都不顯著。其中NP，J1與CK處理相比分別增加了0.03和0.01，達到0.91和0.89，而P處理和J3處理下降至0.86和0.87(表2)。

表2 不同施肥處理下物種多樣性變化

2.2 不同施肥處理對土壤物理性質的影響

2.2.1不同施肥處理對土壤水分、電導率的影響 與CK相比(圖2A)，J1和J3處理的土壤水分顯著降低，分別為30.74%和22.62%(P<0.05)。J1+N和J2增加了土壤水分，增幅分別為4.92%和0.86%。各施肥處理之間土壤電導率總體無顯著差異(圖2B)，與CK相比N處理顯著增加了電導率(P<0.05)，達到304.16 μs·cm-3。

圖2 不同施肥處理下土壤水分和電導率變化

2.2.2不同施肥處理對土壤pH的影響 各施肥處理對土壤pH值影響不同，均呈現堿性(圖3)。與CK相比，處理N和NP顯著降低(P<0.05)，O處理、J1處理、J3處理增加了土壤pH值，各處理間無顯著差異。

圖3 不同施肥處理下土壤pH情況

2.3 不同施肥處理對土壤化學性質的影響

2.3.1不同施肥處理對土壤全氮、全磷的影響 與CK(含量1.58 g·kg-1)相比，除N處理和P處理外，其他處理中全氮含量都有所上升，其中J1+N全氮含量增加最多，達到2.77 g·kg-1，差異顯著(P<0.05)。菌肥施用的J1，J2，J3處理下全氮含量分別為2.64 g·kg-1，2.65 g·kg-1，2.44 g·kg-1(圖4A)。全磷測定顯示，CK全磷含量為0.61 g·kg-1，與其它處理相比只有NP處理顯著提高了土壤全磷含量(P<0.05)，達到0.68 g·kg-1。P處理、O處理和J1處理提高了全磷含量，N處理、J1+N處理、J1+P處理、J2處理和J3處理使全磷含量下降，處于0.56～0.60 g·kg-1(圖4B)。

2.3.2不同施肥處理對土壤銨態氮、硝態氮的影響 各施肥處理和CK相比，均增加了土壤銨態氮的含量(圖5)，其中N處理、NP處理、O處理與CK相比差異顯著(P<0.05)，含量分別為11.11 mg·kg-1，8.19 mg·kg-1，8.86 mg·kg-1，而各菌肥施加處理之間差異不顯著。與CK的硝態氮含量19.34 mg·kg-1相比，只有N處理顯著增加，達到51.58 mg·kg-1(P<0.05)。P處理和O處理對土壤硝態氮含量起到增加的作用，增幅分別約為7.17%和24.03%，但NP處理、J1+N處理、J1+P處理、J1處理和J2處理降低了土壤硝態氮含量，分別是14.08 mg·kg-1，17.76 mg·kg-1，15.39 mg·kg-1，17.37 mg·kg-1和16.71 mg·kg-1，但各處理間無顯著差異。

圖5 不同施肥處理下土壤銨態氮和硝態氮變化

2.3.3不同施肥處理對土壤有機碳的影響 與CK(有機碳含量37.39 g·kg-1)相比(圖6)，只有J3處理增加了土壤有機碳的含量，達到50.69 g·kg-1，且與N處理和NP處理相比，J3增加了土壤有機碳含量，但不顯著。J2處理含量最低，為29.70 g·kg-1，各處理之間差異不顯著。

圖6 不同施肥處理下土壤有機碳情況

3 討論

3.1 不同施肥處理對植物群落特征的影響

在草地生態系統中，施肥通常會導致生物量增加和生物多樣性下降[21]。Kirchner等[22]研究發現，施肥顯著提高草地群落生產力，但物種多樣性有所下降；張春花[23]研究發現施肥顯著降低物種豐富度的同時增加了群落生物量。本研究結果中N處理、J1+N處理都增加了地上植被生產力，以NP處理效果最為顯著(P<0.05)。這是由于氮磷肥可快速有效地增加質地貧瘠土壤的速效養分，改良土壤營養狀況，為植物提供營養物質，同時也促進植被對水的利用效率，從而顯著提高草地生產力[24]。但當菌肥配施氮肥(J1+N)使用時，與CK相比其地上生物量雖無顯著差異，但有一定的增加趨勢，J1+N具有一定的促生作用，但效果不及氮磷復合肥，這可能與不同肥料和施用量的作用以及不同植物類群對施肥的響應差異有關[25]，也可能是施肥年限過短造成地上生物量響應不顯著。本研究中施用全量菌肥(J2，J3)后，地上生物量和CK相比呈下降趨勢，這說明在目前農業生產水平下，全量菌肥未必起到明顯效果，但微生物肥料與化肥合理配施對高寒草地生物量增加有較好效果[26]，同時說明微生物肥料只能部分替代化學肥料。因群落植物物種豐富度和多樣性指數的變化除與植被本身特性有關外，草原土壤基質的改良程度、種間(內)競爭也會對其產生一定程度的影響[27]，施肥提高了土壤養分的可利用性，使得植物之間的競爭由地下轉為地上部分，這也解釋了本結果中PGPR菌肥配施化肥的試驗處理(J1+N，J1+P)下與無機化肥處理(N，NP)其變化趨勢相似，即物種豐富度下降，但J1+N比無機肥下降幅度小，這一結果與Ren[28]、張杰琦等人[29]研究相近，說明因施加微生物肥料的種類不同，草地優勢種生長能力顯著提高，占據群落中的主導地位，在這一過程中其他不同種植物的地位也產生相應變化，群落結構趨于簡單化，物種多樣性有所減少[16]。陳奇樂[30]對河北壩上典型退化草地施用無機肥料發現植被Shannon-Wiener多樣性指數和Pielo均勻度指數隨施肥量的增加呈現減小趨勢，本研究與其發現較為一致，但均勻度指數變化沒有規律。可能是與施肥試驗的時間太短有關，由施肥引起的競爭導致群落中物種遷移過程需要較長的時間，施肥年限較短不足以發生物種水平上的演替，但是競爭會引起各物種的個體數量或密度發生變化[31]。

3.2 不同施肥處理對土壤理化性質的影響

土壤水分不僅影響土壤的物理性質，也制約著土壤中養分的溶解、轉移和微生物的活動，是構成土壤肥力的一個重要因素。本研究發現施用不同類型的肥料對土壤水分有一定的影響，但差異不顯著。與不施肥相比，J1+N和J2處理增加了土壤水分，這與徐暢在馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)施加微生物肥料后，根際土壤含水量增加結果相似[15]，而J1和J3處理則使得土壤水分顯著下降，這說明PGPR菌肥施用的濃度不同使土壤微生物數量增加，加劇微生物消耗土壤含水量的速率，造成土壤水分大幅度下降[32]。

土壤pH值和電導率作為影響植物的生長發育主要因素之一，能夠綜合評估土壤營養離子情況[33]。陳奇樂[30]通過對壩上草地短期施肥發現，施加氮肥有利于降低土壤pH值，本研究結果與之一致。其原因在于施肥過程中過量的氮素增強了植物根系對于土壤中陽離子的吸收能力，使H+大量排出，出現土壤pH值下降現象，對生態系統產生如土壤酸化、鹽基離子流失等一定的負面影響[34]。J1+N并沒有使土壤pH值下降，但J3處理與之相反，這可能與微生物自身代謝有關，因其對土壤難溶養分和有機質有較強的分解和轉化能力，在施用菌肥的情況下進一步促進了養分循環和植物生長的同時，也提高了植物生存的土壤微環境肥力[14]。以上表明菌肥+化肥可以減少無機化肥的施用，且可以緩解土壤鹽漬化。

施肥也會改變土壤的化學性質，影響植物吸收營養元素[35]。李恩宇等[36]研究發現施肥處理對高寒草甸5月和7月份土壤全氮含量均無顯著影響，但土壤速效氮和速效磷含量在7月份最高。本研究表明施加無機化肥(N，NP)可以顯著增加土壤銨態氮和硝態氮含量(0～20 cm)，但是沒有影響全氮含量，總結其原因為高寒草原無機施肥影響了土壤微生物的活性，加速了其對土壤全氮的分解[29]，也可能是因為植物在氮磷等營養元素的作用下快速生長，加速了對土壤中氮營養元素消耗速度[37]。各菌肥處理增加了土壤全氮的含量，其中J1+N處理顯著提高了土壤全氮含量，但沒有提高速效氮含量，說明高濃度的化肥抑制了活菌的活動，或者是PGPR菌肥中的微生物需要對土壤環境有一定的適應過程[38]。研究表明植物對磷吸收能力的大小與土壤理化性質，即含磷水平也密切相關[39]。本研究發現除NP處理外，其它處理對土壤全磷含量均沒有顯著差異，這與陳桂芬[40]、Krey等[12]結果一致，說明除PGPR細菌自身對磷的需求和本地微生物的競爭增強外，植物對磷的吸收也隨著施用有機肥逐漸增強[12]。

適宜的有機碳含量是土壤提供最佳的植物生長條件、養分循環以及有效水分滲入和存儲的重要前提條件[41]。本試驗的P處理和J3菌肥處理增加了有機碳含量，其余處理使得土壤有機碳含量下降。這與Warembourg等人研究相近，歸結其原因主要有:一方面，施用有機肥更有助于土壤有機碳和無機碳庫的積累[42]，土壤可利用氮含量增加，有利于地上植被生長，產生更多的地上凋落物，使得土壤有機質增加；另一方面，由于短期施肥后土壤中碳輸入變多，使得微生物活性增加和碳損變大[43]，導致其處理下土壤有機質下降。因此施肥能夠引起土壤有機質發生增加或減少兩種截然不同變化趨勢，但施肥含量配比對土壤有機質的變化需要進一步探究。

4 結論

不同施肥處理下，PGPR菌肥+70%氮肥不僅沒有減少地上生物量，還可以緩解因施氮肥引起的物種豐富度下降。同時PGPR菌肥+70%氮肥處理增加土壤含水量，并未影響土壤pH值；相較于施氮肥處理，PGPR菌肥+70%氮肥處理提高土壤全氮量，但未增加速效氮和全磷含量。綜上所述，PGPR菌肥并不能完全替代化肥，但在一定程度上菌肥配施無機肥優于單施肥(全量菌肥)效果，其中PGPR菌肥+70%氮肥處理效果最好，能達到促進植物生長和保護生態環境的目的。目前國內外對于PGPR菌肥在田間的應用效果方面仍存在著較大差異。因此，有關其他因素對PGPR菌肥應用效果的影響，還需進一步的研究。