結縷草屬植物雜交后代形態特征和SRAP分子標記鑒定

葉 剛， 張笑笑， 陳靜波， 李建建， 李 玲， 劉建秀， 郭愛桂， 郭海林

(江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014)

結縷草屬(Zoysia)植物是當前廣泛使用的優良暖季型草坪草之一，主要分布于非洲、亞洲和大洋洲的熱帶和亞熱帶地區[1]。結縷草屬植物有11個種，以及若干變種和變型，各個種在形態、生理、遺傳等各方面存在著豐富的變異，這些豐富的遺傳資源為雜交育種及性狀改良奠定了重要的基礎。該草種可適應不同類型的土壤環境，因其具有特定的低維護、耐踐踏、抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄、抗病蟲害等特性，正日益引起國內外草坪草育種家和相關研究者的關注[2-5]，已廣泛應用于運動場草坪、綠地草坪及水土保持草坪等。我國是結縷草屬植物分布最豐富、儲量最大的國家[6]，但由于我國對草坪草的研究起步較晚，至今培育的新品種非常少，不能完全適應我國地域遼闊、氣候類型多樣的環境。

雜交育種作為一種傳統的重要育種方式，可為優良品種的選育提供更多機會，被植物育種家廣泛應用。江蘇省中國科學院植物研究所自2000年就開始了結縷草屬植物的雜交育種工作，并根據結縷草雌蕊先熟，雄蕊后熟的開花習性，采用不去雄的控制授粉雜交方法，但結縷草屬植物雌蕊和雄蕊的開花次序均為從花序頂部到基部依次開花，部分結縷草頂部的花藥開裂時，基部的雌蕊還未萎蔫，導致會產生部分自交后代，自交結實率變異范圍為0～54%，平均為16.15%[7]，因此采用不去雄的方法進行雜交育種就必須對雜交后代的真實性進行鑒定。

形態學鑒定是最直接、最基礎的鑒定方法。結縷草屬的雜交后代主要通過生殖性狀和營養性狀等外部性狀來鑒別，生殖性狀包括生殖枝高度，穗軸長度，花序長度與寬度，小穗長度和寬度等性狀；營養性狀包括葉片長度和寬度，節間長度和直徑，草層高度、密度等。郭海林[8]的研究表明通過對這些外部性狀的調查和測量，可以初步鑒定出結縷草屬雜交后代的真實性。只是形態學特征容易受環境條件以及人為因素的影響，不能真實、準確地反應其后代的遺傳變異，因而需要借助其他技術手段進行輔助鑒定與驗證。分子標記是指可以顯示染色體及其片段、基因或某一特定DNA序列在系譜中的傳遞軌跡的易于檢測的遺傳物質，是DNA水平遺傳多態性的直接反映，受外界環境影響較小，廣泛應用于遺傳圖譜構建、目的基因定位、分子標記輔助育種、植物種質鑒定等諸多領域，并發揮著重大的作用[9-12]。相關序列擴增多態性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)分子標記是基于PCR技術的一種新型分子標記技術，由Li與Quiros于2001年首先開發出來，該標記具有操作簡便快速、結果穩定、便于克隆測序目標片段以及成本較低等特點。本課題組在前期工作中建立了結縷草SRAP-PCR優化體系[13]，并將其應用于結縷草屬植物的雜種真實性鑒定[14]、遺傳多樣性研究[15]和遺傳圖譜構建中[16]，這些研究表明，SRAP分子標記在結縷草屬植物研究中具有穩定性好，檢出效率高的特點。鑒于此，本研究將在前期工作的基礎上，采用形態學標記和SRAP標記技術2種方法同時對結縷草屬19個雜交組合的34份雜交后代進行雜種真實性鑒定，從而使試驗結果更具有說服力，也為下一步的后代選育及其應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為結縷草屬19個雜交組合的27個親本及其34個雜交后代，34個雜交后代分別于2002年和2004年通過人工控制授粉法雜交獲得，目前均種植于江蘇省中國科學院植物研究所苗圃(118°28′ E，32°02′ N，海拔30～40 m)。親本來源、雜交組合和雜交后代信息詳見表1和表2。

表1 結縷草屬雜交組合的親本

續表1

表2 結縷草屬雜交組合及其后代

1.2 試驗方法

1.2.1外部形態鑒定 測量指標：2019年6—7月對27個親本及其34個后代材料的10個形態指標(包括草層高度、密度，葉片長度和寬度，匍匐莖節間長度和直徑，匍匐莖色澤，葉片上下表面茸毛密度和葉舌纖毛密度)進行觀測，并對不同組合的后代形態特征與親本進行比較和方差分析，以初步判斷34個雜種的真實性及其與親本相比的差異性。

測量方法采用郭海林等[8]和周志芳等[17]的方法。

草層高度：指結縷草生長的自然高度，采用五點法進行測量。

密度：指每100 cm2內直立枝的數目，重復測量3次。

葉片長度和寬度：指直立枝上倒3葉完全展開葉的長度和葉片中部寬度，重復測量10次。

匍匐莖節間長度和直徑：隨機選取健康生長的匍匐莖，測量倒4節的長度和中部位置的直徑，重復測量10次。

匍匐莖色澤：采用5級制，綠色為1，黃褐為2，褐色為3，淺紫為4，深紫為5。

葉片上/下表面茸毛密度：目測葉片上/下表面茸毛狀況，無或極疏為1，疏為2，密為3。

葉舌纖毛密度：目測葉片葉舌纖毛狀況，無或極疏為1，疏為2，密為3。

數據處理和分析：每個參試材料測試的形態指標平均數用Excel 2019軟件進行計算，并利用SPSS 26.0軟件對每一組合的親本和后代的每個形態指標進行方差分析和多重比較，從而比較雜交后代和親本之間的關系，判斷其真實性。

1.2.2分子標記鑒定 雜交后代及其親本基因組DNA的提取和檢測：雜交后代及其親本基因組DNA的提取和檢測，采用薛丹丹等[13]和郭海林等[18]的方法。

SRAP引物組合：SRAP引物設計參考Li和Quiros的方法[19]。根據SRAP-PCR反應體系，隨機選取7條正向引物和10條反向引物[20，21]，共組合成70對SRAP引物，用于后代的真實性鑒定，其序列見表3。

表3 SRAP引物序列

SRAP-PCR擴增程序及擴增產物的檢測：應用雜交親本材料對SRAP引物組合進行篩選，從中獲得具有擴增條帶清晰、豐富的父本特征性條帶的引物組合，用于雜交后代的真實性鑒定，每一個引物組合重復試驗一次。

SRAP-PCR擴增體系為：總體積10 μL，PCR Mix 5.0 μL，2 mmol·L-1引物1.0 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 2.5 μL，PCR Mix購自南京博彩生物科技有限公司，DNA Marker購自南京TaKaRa公司。

SRAP-PCR擴增程序為：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個循環；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；循環結束后72℃延伸7 min，4℃保存。擴增反應在TC-412型擴增儀(TECHN公司,英國)中進行。

擴增產物的檢測：SRAP-PCR反應結束后，在擴增產物中加入2 μL 6×Loading buffer混勻，上樣于10%的聚丙烯酰胺凝膠，用240 V電壓進行電泳分離約2.0 h(DYY-8B型電泳儀,JY-SCZ6型電泳槽,北京六一)，然后在搖床上進行銀染檢測，并拍照記錄。

雜交后代真實性鑒定：應用表3中引物組合，以清晰穩定的父本特征帶為判斷依據，分別對各雜交組合進行雜種真實性鑒定，后代擴增結果中具有父本相對于母本的特異型帶的即為真雜種，而只具有母本特異條帶無父本特征帶的后代則為假雜種或自交種。每一特征引物組合重復試驗一次，此外還同時用多個引物進行鑒定，最后依據父本特征帶對試驗結果進行統計。

2 結果與分析

2.1 雜交后代的外部形態鑒定

通過對結縷草屬植物19個雜交組合的親本及其雜交后代的10個外部性狀進行觀測，并對同一組合的后代與親本觀測結果進行方差分析(表4和5)，結果發現同一組合的不同后代在10個外部性狀上存在不同程度的差異，且大部分雜交后代的外部性狀與母本或雙親都存在顯著性差異。對34個后代的變異和鑒定情況分析如表6所示。由表6可知，根據形態特征，34個后代中除了0402-6，0402-8，0404-4，0404-5因有6個或6個以上的外部性狀都與母本無顯著性差異可能為假雜種，其余30個雜交后代觀測的10個外部性狀中至少有5個外部性狀與母本存在顯著差異，因此初步判斷它們為真雜種。

表4 19個雜交組合的外部性狀多重比較及變異分析

續表4

續表4

表5 19個雜交組合的形態指標變異范圍分析

表6 34個后代的外部性狀多重比較及變異分析

續表6

2.2 雜交后代的SRAP分子標記鑒定

以70對SRAP引物對19個雜交組合的雜種真實性從分子標記的角度進行鑒定，以父本相對于母本的清晰的特征帶為判定標準。結果發現70對引物中可以用16對引物將34個后代鑒定為真雜種。

首先用引物組合Me1Em1和Me1Em2對全部19個雜交組合的后代進行鑒定，結果0204，0210，0217，0233，0404等5個雜交組合的全部后代在引物Me1Em1中都擴增出各自的父本特征條帶，均被鑒定為真雜種，0232，0233，0238等3個雜交組合的后代用引物Me1Em2鑒定為真雜種；然后用引物組合Me1Em3，Me1Em4，Me1Em5，Me1Em6對余下的12個雜交組合進行鑒定，結果引物Me1Em5將0228雜交組合的后代0228-4鑒定為真雜種，引物Me1Em6將0237雜交組合的兩個后代鑒定為真雜種；緊接著用Me1Em 7，Me1Em8，Me1Em9等5對引物組合對余下的10個雜交組合進行鑒定，引物Me1Em9在0402，0410，0201，0202，0204，0221，0232，0234，0236，0419共10個組合的父本中擴增出了特異性條帶，其中0201，0221，0234，0419四個雜交組合的全部后代都擴增出父本特征條帶，被鑒定為真雜種，引物Me1Em7和Me1Em8將0207和0412這2個雜交組合的后代鑒定為真雜種；又用Me5Em9，Me5Em10，Me6Em1，Me6Em2等10對引物組合對余下4個雜交組合進行鑒定，結果Me5Em9，Me5Em10，Me6Em1，Me6Em3，Me6Em6，Me6Em7等6對引物均可以將0202雜交組合的4個后代鑒定為真雜種，而0236雜交組合的3個后代中只有2個后代0236-7，0236-8被Me5Em9和Me6Em1兩對引物鑒定為真雜種，0402雜交組合則用Me5Em9和Me6Em2兩對引物鑒定為真雜種；最后用Me7Em1，Me7Em2，Me7Em3等10對引物組合對余下2個雜交后代0236-4，0410-3進行鑒定，結果在引物Me7Em5中兩個后代材料均擴增出各自的父本特征條帶，鑒定為真雜種。據此，34個雜交后代全部鑒定為真雜種。如圖1，以引物Me1Em9對其中10個雜交組合后代的鑒定結果為例。對所有親本雜交組合的后代雜種鑒定結果統計見表7。

圖1 Me1Em9對其中10個雜交組合后代的鑒定結果

表7 雜種鑒定結果

3 討論

3.1 形態特征鑒定

形態學標記因其具有快速、簡便，無需昂貴的儀器設備等特點，成為育種者們進行雜種鑒定和遺傳多樣性研究的重要手段，在蕓薹屬、菊屬、辣椒屬、月季、小麥[22-26]等植物中都有較多的報道。本研究通過對親本和后代的外部性狀觀測值進行方差分析，結果發現各組合的親本和后代之間均存在不同程度的差異，且同一組合不同后代的外部性狀之間也有較大變異，說明通過雜交育種使結縷草屬植物后代產生了基因重組現象，從而導致后代間發生了豐富的變異，進一步為新品種的選育工作提供了基礎。由親本和后代的變異范圍可知，不同組合雜交后代的10個外部性狀變異范圍存在較大的差異，后代變異范圍超出親本的最高達到80%，最小只有20%。利用10個營養性狀指標對結縷草屬植物19個組合27個親本和34個后代的變異情況進行了比較分析，結果發現有30個雜交后代的多個外部性狀均與父母本存在顯著差異，初步判斷它們為真雜種，而另外4個后代0402-6，0402-8，0404-4和0404-5分別有6個或6個以上的外部性狀與母本無顯著性差異，從外部性狀上不能確定其為真雜種，必須借助于分子標記等技術手段對其作進一步的鑒定。

3.2 分子標記鑒定

隨著生物化學和分子生物學的快速發展，分子標記技術在各個研究領域得到了廣泛的應用[8-11]。與形態學鑒定相比較，分子標記技術不受植物正常生理代謝及環境變化的影響，能從遺傳物質DNA水平研究植物基因的變化，操作更簡單，結果更精確[25]。SRAP分子標記技術具有引物設計簡單，通用性高等優良特性，已被廣泛應用于多種植物的遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖譜的構建、基因定位、植物種質鑒定和分子標記輔助育種中，并已在假儉草[27]、海雀稗[28]、狗牙根[29-30]等草坪草的遺傳圖譜構建、遺傳多樣性研究、新品系鑒定等研究中發揮了重要作用。本文應用SRAP分子標記技術對來自于19個雜交組合的34個后代進行雜種鑒定，結果表明，全部后代因具有父本的特征帶而被鑒定為真雜種。同時，從雜種擴增的條帶看，雜種譜帶并不是雙親譜帶之和，而是出現了新譜帶的增加或某些譜帶的消失，同一雜交組合中的后代在相同的引物下擴增的條帶也不一致，另外，本研究利用不同的SRAP引物對同一組合的后代進行多次鑒定獲得了更準確的結果。這些結果均表明結縷草屬植物通過雜交育種導致了后代的基因重組，并產生了豐富的變異，這都為雜交后代的選育工作提供了依據。同時雜交后代真實性的鑒定也為進一步選育優良雜交后代奠定了基礎。

4 結論

本文通過形態學和分子標記兩種鑒定手段對結縷草屬植物19個雜交組合的34個后代雜種真實性進行了鑒定。結果表明，形態學鑒定中有30個后代因其在測定的外部性狀上與父本無顯著差異而與母本有顯著差異，因此初步推斷其可能為真雜種，而另外4個后代因在外部性狀上與母本差異不顯著或僅有少數性狀與母本有差異，不能確定其是否為真雜種，進而通過SRAP分子標記技術鑒定其雜種的真實性，兩種方法的有效結合，最終將34個雜交后代全部鑒定為真雜種，為后續研究和新品種選育奠定了良好的基礎。