草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3基因的克隆及表達(dá)分析

金一鋒， 陳 陽， 齊 欣， 高巖松， 金忠民， 趙清峰， 王 琦

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

生態(tài)園林已成為我國現(xiàn)代城鄉(xiāng)一體化建設(shè)的主要目標(biāo)，草坪對改善城市生態(tài)環(huán)境，維護(hù)生態(tài)平衡有重要作用。草地早熟禾(PoapratensisL.)是優(yōu)質(zhì)的冷季型草坪草，廣泛用于北方城市園林建設(shè)。氮素和干旱顯著影響草坪草的觀賞價(jià)值，草坪草在氮素供應(yīng)不足或者干旱脅迫時(shí)，常呈現(xiàn)出黃化、低矮、抗逆能力差等現(xiàn)象[1]。在旱地生態(tài)系統(tǒng)中，硝態(tài)氮是植物生長發(fā)育的主要氮素來源，土壤干旱影響植物硝態(tài)氮的同化過程中氮素的吸收與利用，而未被植物吸收的硝態(tài)氮易淋移和揮發(fā)進(jìn)入地表水、地下水及大氣，對其造成污染[2-3]。因此，植物逆境脅迫下硝態(tài)氮吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程受到許多研究者的關(guān)注。

硝酸根離子的吸收是植物硝態(tài)氮利用過程的第一步，其中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Nitrate transporter，NRT)在吸收和感知外界硝酸鹽及信號調(diào)控方面有著重要的作用，因此硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物氮素營養(yǎng)系統(tǒng)的關(guān)鍵生物大分子之一。高等植物存在的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括：高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(HATS)，低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(LATS)，雙親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要由NRT2家族編碼，而低親和性硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在外源硝態(tài)氮濃度較高時(shí)發(fā)揮作用，主要由NRT1/PTR FAMILY(NPF)家族編碼[4-6]。對植物NPF的研究發(fā)現(xiàn)，它不僅是硝酸鹽或肽轉(zhuǎn)運(yùn)體，部分NPF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還可以運(yùn)輸不同的底物，如：硝酸鹽/生長素、硝酸鹽/脫落酸、硝酸鹽/硫代葡萄糖苷或赤霉素/茉莉酸[7-8]。

有關(guān)于擬南芥和水稻的NPF家族基因的研究較為深入，很多基因的功能已被鑒定[9-18]。目前關(guān)于禾本科草坪草NPF家族基因的研究較少，克隆并鑒定草地早熟禾N(yùn)RT1/PTRFAMILY家族基因的功能，有助于研究草地早熟禾硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)過程，豐富草坪草硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制相關(guān)研究。本研究克隆草地早熟禾N(yùn)RT1/PTRFAMILY8.3基因，并對其進(jìn)行理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、同源進(jìn)化關(guān)系等生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定不同組織及不同氮素形態(tài)、氮素濃度、干旱脅迫下的基因表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究其功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理方法

試驗(yàn)于 2019年3-8月在齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院園林園藝遺傳育種研究室進(jìn)行，試驗(yàn)所用材料草地早熟禾為‘午夜2號’品種。試驗(yàn)材料置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng) 50 d以上，培養(yǎng)條件參數(shù)設(shè)置為：晝夜溫度為25℃/15℃，光/暗為13 h/11 h，光照強(qiáng)度為400 μmol·m-2·s-1，相對濕度(65±5)%。

選取生長健康、長勢一致的草地早熟禾幼苗，將其根部洗凈后置于1/2 Hoagland水培液中，待培養(yǎng)14 d后進(jìn)行氮素、干旱處理。具體處理分組為：(1)采用NaNO3(單一硝態(tài)氮)為氮源配置不同氮素濃度梯度的水培液處理植株，研究目標(biāo)基因的表達(dá)情況，氮素濃度分別為0 mM (NN)，1.5 mM (LN)，7.5 mM (ON)，15 mM (HN)，每2 d更換1次培養(yǎng)液，14 d后取樣;(2)采用硝態(tài)氮(NaNO3)、銨態(tài)氮((NH4)2SO4)、混合態(tài)氮(NH4NO3)水培液處理植株，14 d后取樣，研究相同氮素水平時(shí)(N濃度為7.5 mM)不同氮素形態(tài)處理下目標(biāo)基因的表達(dá)情況;(3)將10% PEG-6000 (Polyethylene glycol) 加入1/2 Hoagland營養(yǎng)液中，對植株進(jìn)行模擬干旱處理，干旱誘導(dǎo)時(shí)間分別為：0 h，2 h，16 h;(4)采用1.5 mMNaNO3，15 mMNaNO3水培溶液處理14 d的植株，置于10% PEG-6000中，16 h后進(jìn)行取樣。以上處理植物的取材部位均為葉部，每個(gè)處理 3次生物學(xué)重復(fù)，置于-80℃保存。

1.2 草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組測序

提取NN，LN，ON，HN 4個(gè)處理組的草地早熟禾植株葉片總RNA，送生工生物工程股份有限公司(上海)通過Illumina HiSeqTM2500平臺進(jìn)行RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序。對于Trinity拼接得到的非冗余轉(zhuǎn)錄本，提取最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，作為后續(xù)分析的參考序列。

1.3 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3基因克隆

利用植物總RNA提取試劑盒(TianGen，BeiJing)進(jìn)行草地早熟禾葉片總RNA的提取。利用Nanodrop 2000檢測RNA濃度與純度，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。以草地早熟禾總RNA為模板，采用PrimeScriptTMII 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，Japan) 將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于NRT1/PTRFAMILY8.3基因克隆。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的草地早熟禾相關(guān)序列為基礎(chǔ)，結(jié)合Genebank公布的二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)NRT1/PTRFAMILY8.3(XM_020332740.1)，設(shè)計(jì)特異性引物NRT1/PTRFAMILY8.3-F:5′-CCATTCCCCTC CCCCATG GCAT-3′,NRT1/PTRFAMILY8.3-R:5′-ATCCTGCTAGTTATTGTGTAATCTTTG-3′。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性2 min,退火56℃ 30 s,延伸72℃ 45 s，共32個(gè)循環(huán)，最終延伸72℃ 5 min，獲得草地早熟禾N(yùn)RT1/PTRFAMILY8.3基因ORF片段。引物的合成和測序由生工生物工程股份有限公司(上海)完成。

1.4 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI中CDD工具進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)功能域分析；利用DNAMAN進(jìn)行氨基酸同源性比對分析；利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，相關(guān)蛋白的保守基序分析使用MEME(http://meme.sdsc.edu)進(jìn)行；利用ProtParam分析NRT1/PTR FAMILY8.3蛋白的基本理化性質(zhì)；利用SOPMA在線預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODE預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

分別提取同一氮源不同氮素濃度梯度、同一氮素水平不同氮源、及模擬干旱處理后草地早熟禾不同組織部位(根、莖、葉)的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為后續(xù)PCR擴(kuò)增的模板。采用qRT-PCR的相對定量方法，參照TB GreenTMPremix Ex TaqTMII進(jìn)行試驗(yàn)。qRT-PCR反應(yīng)體系為50 μL，包含：4 μL cDNA，2 μL Q-NRT1/PTRFAMILY8.3-F(5′-ATGCCTCTGCAG GATCATGTG-3′),2 μL Q-NRT1/PTRFAMILY8.3-R(5′-GGCTCGCCGCCTCAACGTTG-3′)，17 μL ddH2O，25 μL TB Green Premix Ex Taq II。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。選擇的內(nèi)參基因?yàn)椴莸卦缡旌蘒BQ，Q-UBQ-F:AGAAGAAGACCTACACCAAG，Q-UBQ-R:GGTTGTAAGGCGTAGGTGAG。該試驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)3次，利用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3基因全長cDNA克隆

以草地早熟禾葉片cDNA為模板，Q-NRT1/PTRFAMILY8.3-F和Q-NRT1/PTRFAMILY8.3-R為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條大小為2 274 bp的特異條帶(圖1)，經(jīng)測序?qū)⑺眯蛄忻麨镹RT1/PTRFAMILY8.3。草地早熟禾N(yùn)RT1/PTRFAMILY8.3基因序列全長2 274 bp，含1 260 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼419個(gè)氨基酸(圖2)。

圖1 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3基因的擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3基因序列

2.2 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3 編碼蛋白序列分析

通過NCBI中CDD在線分析發(fā)現(xiàn)，草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3含有The Major Facilitator Superfamily(MFS)結(jié)構(gòu)域，分別為在第30～232位含有233個(gè)氨基酸的MFS結(jié)構(gòu)域和在第319～415位含有97個(gè)氨基酸的MFS結(jié)構(gòu)域，它們均屬于MFS超家族(圖3)。利用ProtParam軟件對草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，經(jīng)分析表明，草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3蛋白質(zhì)分子式為C2056H3204N536O580S25，為穩(wěn)定蛋白，分子量為45.51 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為7.5。該蛋白表面帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)、正電荷的氨基酸殘基(Arg + Lys)分別有31個(gè)和32個(gè)，平均親水系數(shù)為0.310。Protscale在線蛋白親疏水性分析顯示NRT1/PTR FAMILY 8.3屬于親水性蛋白，平均親疏水系數(shù)為0.310，疏水性在第375位點(diǎn)最強(qiáng)，分值為2.689，親水性在第27位點(diǎn)最強(qiáng)，分值為—2.553(圖4)。

圖3 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3功能結(jié)構(gòu)域

圖4 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3蛋白的親水性分析

通過SOPMA軟件對草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示：草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3蛋白主要由α-螺旋(43.2%)和不規(guī)則卷曲(35.80%)組成，另加少量的延伸鏈(16.95%)和β-轉(zhuǎn)角(4.06%)(圖5)。該二級結(jié)構(gòu)組成與進(jìn)一步利用SWISS-MODEL三維建模的預(yù)測結(jié)果一致(圖6)。

圖5 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖6 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3蛋白的三級結(jié)構(gòu)

利用MEGA 7.0及MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)進(jìn)行氨基酸比對，進(jìn)一步了解不同物種中NRT1/PTR FAMILY 8.3氨基酸同源進(jìn)化關(guān)系(圖7)。草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3與二穗短柄草的NRT1/PTR FAMILY 8.3(XP_014757425.1) 同源性最高。由圖7可知，多個(gè)禾本科植物(Gramineae)的NRT1/PTR FAMILY 8.3氨基酸序列匯集在一起，與棕櫚科(Palmaceae)、鳳梨科(Bromeliaceae)植物NRT1/PTR FAMILY 8.3的親緣距離較近，與豆科(Leguminosae)、薔薇科(Rosaceae)較遠(yuǎn)。通過MEME保守域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)眾多物種的NRT1/PTR FAMILY 8.3氨基酸序列包含8個(gè)保守域序列：motifs-1，QDZDAGLYTGDGSVDIKGNPALKQNTGNWR ACPFILGTECCERLAYYGIA；motifs-2，TNLVT YLTKKLHZGNVSAARNVTTWQGTCYLTPLJ-GAVLADSYWGRYWTI；motifs-3，GLYLIALGT GGIKPCVSSFGADQFDDTDPAERVKKG SFFNWFYFSINIGA；motifs-4，JVWIQDNAGWGLGF GIPTLFMAJAIASFF；motifs-5，TPLYRFQKPGGSPLTRMCQWVAAFRKWNVDVPH-DSSLLYETP；motifs-6，ESAEGSRKLEHTDELKFLD KAATISSAD；motifs-7，NPWRLCTVTQVEEL KILIRMFPIWATGIVFSAVYAQMSTMF；motifs-8，IPPASLSTFDVISVIIWVPVYDRVLVPIARKF TGKERGFSELQRMGIGLF。

圖7 同源進(jìn)化關(guān)系分析

2.3 NRT1/PTR FAMILY 8.3基因在不同組織及脅迫中的表達(dá)分析

為了解草地早熟禾N(yùn)RT1/PTRFAMILY8.3在不同組織的表達(dá)模式，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對定量方式進(jìn)行了組織特異性表達(dá)分析，qPCR結(jié)果顯示：草地早熟禾N(yùn)RT1/PTRFAMILY8.3基因在不同組織部位中表達(dá)差異顯著(圖8-A)，相對表達(dá)量的高低依次為：根部>葉部>莖部，但根部和葉部的表達(dá)量差異不顯著。

圖8 草地早熟禾N(yùn)RT1/PTR FAMILY 8.3基因在不同組織及氮素、干旱處理中的表達(dá)分析

3 討論

4 結(jié)論

本研究成功克隆獲得草地早熟禾N(yùn)RT1/PTRFAMILY8.3基因，該基因序列大小為2 274 bp，編碼了419個(gè)氨基酸，含有MFS結(jié)構(gòu)域，屬于MFS超級家族，與二穗短柄草NRT1/PTR FAMILY8.3同源性最高。草地早熟禾N(yùn)RT1/PTRFAMILY8.3基因在根部和葉部中表達(dá)量較高。無氮和高氮環(huán)境利于草地早熟禾N(yùn)RT1/PTRFAMILY8.3基因表達(dá)，干旱促進(jìn)NRT1/PTRFAMILY8.3基因表達(dá)；水氮互作時(shí)，低氮且干旱促進(jìn)其表達(dá)，高氮且干旱抑制其表達(dá)。對草地早熟禾N(yùn)RT1/PTRFAMILY8.3克隆與表達(dá)分析有利于進(jìn)一步研究該基因功能。