野豌豆屬種子形態多樣性與種子分類鑒定方法的研究

劉博文， 黎桂陽， 常媛飛， 金美燕， 劉芳， 高秋， 劉萬良， 哈斯塔米爾， 王顯國*

(1. 中國農業大學草業科學與技術學院， 北京 100193； 2. 河南省綠色工程有限公司, 河南 鄭州 450000； 3. 全國畜牧總站， 北京 100125； 4. 烏蘭浩特市林業和草原局草原工作站， 內蒙古 烏蘭浩特 137400； 5. 阿魯科爾沁旗紹根鎮人民政府， 內蒙古 赤峰 025567)

野豌豆屬(ViciaL.)屬于豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionatae)野豌豆族(Viciae)一、二年生或多年生草本。本屬植物約有180～210種，主要分布在歐洲、高加索和中國[1-4]。農業上該屬植物主要作為牧草和綠肥以及冬季覆蓋作物，此外也可食用或作為觀賞作物和藥用植物[5-10]。救荒野豌豆(ViciasativaL.),毛苕子(ViciavillosaRoth),光葉紫花苕(ViciavillosaRoth var.)等栽培馴化種均被世界各國廣為栽培[11-13]，以山野豌豆(ViciaamoenaFisch. ex DC.)為代表的眾多野生種類多為我國天然草地重要組成物種，飼用價值高、抗逆性強[11,14]，且飼草品質可以與苜蓿(MedicagoSativaLinn)相媲美，極具栽培馴化潛力[15-16]。然而大部分野豌豆屬植物尚未馴化，而對野豌豆屬植物的開發與利用離不開對其遺傳多樣性與分類鑒定的研究。

由于野豌豆屬植物的植株形態變異幅度難以掌握，不同學者在其屬下分類、種間和種下分類的處理上大有不同。1976年Kupicha[17]第一次提出將野豌豆屬分為Vicilla和Vicia兩個亞屬，并分別分為17和5個組；Maxted[18]又將Vicia亞屬分成9個組，38個物種、14個亞種和22個變種，后有研究認為Vicilla亞屬應改為Cracca[19-20]；夏振岱[21]在1996年的研究中表明我國共43種，4變種和6變型，并整理為6個組；劉云波和趙一之[1]將Cracca組和Cassubicae組合并為Cracca組；賀蓉等[22]將硬毛果野豌豆(Viciahirsuta(L.) S. F. Gray)歸于Cracca組；《中國植物志》中將四籽野豌豆(Viciatetrasperma(L.) Schreber)，組中的小巢菜(Viciahirsuta(L.) S. F. Gray)單獨歸為硬毛果野豌豆組，在2019年將原來單獨為一個種的窄葉野豌豆改為救荒野豌豆的亞種?？梢娨巴愣箤俚姆诸愄幚斫Y果在不同學者間尚不一致，因此有必要對野豌豆屬植物進行進一步的鑒定并分類，以利于野豌豆屬植物的利用。

形態學研究是種質資源的鑒定、評價和多樣性研究中最為簡單、表現直觀、經濟節約的方法。種子形態特征經常作為研究對象用以區分種類。種子生長環境與其他營養器官相比較為封閉，受到的外界環境因子的影響較小。因此，種子形態特征相對穩定，其在分類學上有重要意義[27-32]。野豌豆屬種子，從蠶豆(ViciafabaL.)到四籽野豌豆大小差異較大，種皮顏色各不相同，都可作為種間分類依據[23-24]。Buykka等[25]發現救荒野豌豆硬籽品種的種子較軟籽品種的種子小。Ann[26]對野豌豆不同種類的種胚進行觀察研究，表明子葉的形狀和顏色，胚根的形狀、顏色和位置，胚芽的顏色等形態特征變異豐富并且可作為野豌豆屬的分類的輔助特征。

為了促進野豌豆屬植物的開發利用，進一步完善野豌豆屬植物的分類鑒定，本研究通過對14種的48份野豌豆屬材料的種子形態的多樣性進行分析，旨在揭示野豌豆屬形態水平的遺傳多樣性，并確定可作為野豌豆屬分類鑒定的種子形態特征的指標，探討其系統分類，為野豌豆屬物種鑒定和分類提供形態學的依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料均來自于全國畜牧總站草種質資源庫(表1)。

表1 供試材料名稱與來源

續表1

續表1

1.2 試驗方法

參照種子形態性狀的規范和描述選擇17個種子性狀[33-37]。種子長、種子寬、種臍長測量方法如圖1所示。選擇相對均勻的種子每份材料10粒，剝去種皮，在解剖鏡下觀察其胚根顏色和形狀等并拍照，然后用image J軟件對胚根的長度(從胚根的基部到尖端的距離)和寬度(胚根基部寬度)進行統計[26]，具體測定及賦值方法見表2。

圖1 種子長、種子寬、種臍長、胚根長和胚根寬的測量示意圖

表2 野豌豆屬種子表型性狀測量指標

1.3 數據處理與統計分析

用Excel表格進行數據統計，利用SPSS 25軟件分析各性狀平均值(X)、標準差(S)、變異系數(CV)等。

式中X為測定指標具體數值，N為重復數。

H′=-∑Pi×LnPi

式中Pi為性狀第i級別內材料份數占總份數的百分比，Xi為第i級中的數據。

相關性分析和主成分分析用SPSS 25軟件進行。聚類分析采用軟件為NTSYSpc2.10，用其中UPGMA方法(Unweighted Pairgroup Method Arithmetic Averages不加權成組算術平均數法) 進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖(phenogram)[39]。

2 結果與分析

2.1 野豌豆屬種子形態特征分析

2.1.1數量性狀 10個數量性狀統計結果見表3。結果顯示：不同材料百粒重之間存在顯著差異(P<0.05)，最大為13.62 g，最小為0.36 g；種子長、種子寬和種子厚最大的均為法國野豌豆(48)，最小的為四籽野豌豆(41)，這與百粒重的結果相同；種形指數在0.83～1.21之間，說明野豌豆屬種子基本上處于橢圓形到球形之間；種臍長度在1.36 mm～4.39 mm之間，臍長/種子長的比值在38%～100%之間；胚根長在0.61～2.46 mm之間，胚根寬在0.46～1.73 mm之間，胚根寬/胚根長在34%～168%之間。

表3 野豌豆種子數量性狀的變異分析及遺傳多樣性分析

2.1.2質量性狀 7個質量性狀分析結果見表4。結果表明：種皮顏色依次分為黃色、黃褐色、紅褐色、棕色、灰色和黑色；根據種子顏色是否含有雜色，分為有無紋理，多數野豌豆種子種皮有紋理；種臍形狀由線形到棒狀，種臍顏色根據材料分為7個不同顏色，胚根尖端的形狀分別呈現出銳尖、漸尖和鈍，胚根基部呈現有斑紋和無斑紋兩種類型；子葉顏色主要為黃色，并細分為淺黃色、黃色和橘黃色。

表4 野豌豆屬種子質量性狀的變異分析及遺傳多樣性分析

2.1.3野豌豆屬種子形態變異分析 變異系數和Shannon多樣性信息指數都是反映種質資源多樣性的指標，變異系數表示某一種表型性狀的變異范疇，Shannon多樣性信息指數表示種質資源不同表型性狀的分級和數量的分布情況。

48份野豌豆17個種子表型性狀的平均變異系數為36.05%，百粒重最大，為81.92%，種形指數最小，為6.85%；種皮顏色、種臍顏色和百粒重變異系數均超過60%，其他指標變異系數均在20%～40%之間。Shannon多樣性信息指數的平均值為1.42。數量性狀多樣性信息指數最大為種形指數(1.94)，最小為百粒重(1.58)；質量性狀多樣性信息指數最大為種臍顏色(1.56)，最小為種皮紋理(0.51)。結果表明我國野豌豆屬種間各形態指標在統計學上差異顯著，變異豐富，可依據種間變異較大的指標來對野豌豆植物進行準確分類。

2.2 48份野豌豆屬植物種子的17個形態性狀的主成分分析

主成分分析可以詳細地了解野豌豆屬不同種間存在差異的主要原因。主成分分析結果如表5所示，以特征值大于1為標準提取主成分，前6個主成分累計貢獻率為86.09%。第一主成分的貢獻率為37.39%，其中載荷最大為種子寬，其次是胚根長、百粒重、種子長、種子厚、種臍形狀，載荷均超過0.80。第二主成分的貢獻率為17.08%，載荷最大為種臍長，其次是種皮顏色、種臍長/種子長、胚根寬和種形指數。第三主成分的貢獻率為10.83%，其中載荷最大為種皮紋理，其次是種臍顏色和種皮顏色。第四主成分累計貢獻率為8.16%，載荷最大為胚根寬，其次是胚根寬/胚根長和子葉顏色。第五主成分累計貢獻率為6.64%，載荷最大為胚根尖端，其次是種形指數。第六主成分累計貢獻率為6.00%，載荷最大為子葉顏色。六個主成分中，載荷較大的指標在一定程度上可表明各種間存在差異的原因，即供試的14個種間差異是由于上述指標間的變異而形成的。

表5 野豌豆屬種子形態指標的主成分載荷矩陣和累積貢獻率

2.3 數量性狀的相關性分析

對48份野豌豆屬材料種子的10個數量性狀進行相關性分析(表6)。結果表明種子各性狀間表現出復雜的相關性。代表種子大小的性狀種子長、種子寬、種子厚和百粒重相互之間呈極顯著正相關關系(P<0.01)，這些性狀與胚根長也呈極顯著正相關關系(P<0.05)，說明種子越大，胚根長度越長。種臍長與百粒重、種子寬、種形指數呈顯著正相關關系(P<0.05)，與種子長、種子厚呈極顯著正相關關系(P<0.01)。臍長/種子長與種子長、種子寬、百粒重和種子厚均呈極顯著負相關關系(P<0.01)。胚根寬與種子長、種子寬呈極顯著正相關關系(P<0.01)，與種子厚和種臍長呈顯著正相關關系(P<0.05)。胚根寬/胚根長與種子長、種子寬、百粒重和胚根長均呈極顯著負相關關系(P<0.01)，與種子厚呈顯著負相關關系(P<0.05)，與臍長/種子長和胚根寬呈極顯著正相關關系(P<0.01)。根據各指標間的相關關系，可依據其中任一指標來確定其他指標的性狀表現，為種間鑒定性狀的選擇提供依據。

表6 野豌豆屬種子數量性狀間的相關關系

2.4 48份野豌豆屬植物種子的聚類分析

根據種子形態性狀對本次供試的48份野豌豆屬材料進行聚類分析，結果表明在相似性系數為0.790的時候可以分為5大類群(圖2所示)。第一類群共13份材料，分為兩個亞類，第一亞類包括1份窄葉野豌豆(14)，1份救荒野豌豆(1)和1份法國野豌豆(48)，第二亞類包括10份救荒野豌豆(2，4，5，10，8，3，9，7，11，6)。第二類群共4份材料包括1份窄葉野豌豆(13)和3份野豌豆(21，22，23)。第三類群共6份材料，分為兩個亞類，第一亞類包括1份窄葉野豌豆(12)和1份長柔毛野豌豆(17)，第二亞類包括4份長柔毛野豌豆(16，18，19，20)。第四類群包括17份材料，分為兩個亞類，第一亞類包括3份廣布野豌豆(24，25，26)，2份大花野豌豆(27，28)，1份長柔毛野豌豆(15)和3份歪頭菜(42，43，44)，第二亞類包括2份大葉野豌豆(32，33)，3份山野豌豆(37，38，39)和3份黑龍江野豌豆(34，35，36)。第五類群共8份材料，分為三個亞類，第一亞類為3份大野豌豆(29，30，31)，第二亞類為2份四籽野豌豆(40，41)，第三亞類為3份小巢菜(45，46，47)。

圖2 48份材料種子形態聚類結果圖

3 討論

種子作為植物重要的繁殖器官，其形態特征對于植物分類的重要性很早就被植物學家所認識[40]。對種子微觀形態的研究，可以為植物屬和種的系統劃分提供科學的理論依據[41]，并揭示植物屬間或種間遺傳特征[42]。段朋娜[43]研究表明，爵床科(Acanthaceae)種子形態具有種間特異性，種子大小在爵床科種間分類上具有重要意義。劉洋等[44]的研究也表明，從小粒野生大豆到大粒半野生大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)各類型的遺傳分化與它們的百粒重大小有密切關聯。百粒重大小可以作為評價野生大豆物種內的遺傳分化或進化程度的主要指標之一有其遺傳上的理論依據。Salimpour等[45]探究三葉草(TrifoliumpratenseL)的種子形態特征得出，種子形態、大小是Lotoidea地區三葉草重要的分類特征。本研究通過對野豌豆屬種子形態特征進行分析，發現種形指數在0.83～1.21之間，變異系數僅6.85%，該屬種子基本處于橢圓形到球形之間，種間差異小，具有一致性，供試材料不能依據種形進行分類鑒定。但表示種子大小的種子長、種子寬、種子厚和百粒重等指標均表現出豐富的變異，可依據相關指標對不同種進行鑒定分類。

種子顏色在多種植物中都已作為重要的分類指標[46-47]。本研究種子種皮顏色有黃色、黃褐色、紅褐色、灰色和黑色5種顏色，變異系數較高，達到64.30，Shannon多樣性信息指數1.48。而Hosseinzadeh[48]將野豌豆屬種子的種皮顏色分為底色和斑紋色，其中底色有淺棕色、綠色和奶油色，斑紋顏色為深棕色、黑棕色、棕色和黑色。本研究野豌豆屬種子的種皮顏色之所以與Hosseinzadeh研究結果表現出不同，與植物所處的海拔，棲息地，植物高度以及其系統發育有關[49-50]。正因為同種植物由于生境不同造成不同學者之間研究的差異，對國內野豌豆屬植物的分類鑒定是十分必要的。本研究中廣布野豌豆種皮顏色為褐色，這與胡振天等[51]研究野生廣布野豌豆種皮顏色黑褐色相近。彭艷等[52]在對我國西藏野豌豆種質資源研究中發現山野豌豆表皮為深褐色或黑褐色。本研究中山野豌豆種皮顏色為黑色，可見山野豌豆表皮為褐色或黑色，為該種種子的特征之一。供試材料中長柔毛野豌豆、四籽野豌豆和法國野豌豆種皮顏色一致，無雜色，其他材料均有紋理，種皮紋理可在一定范圍內區分供試材料。Marin等[53]對種皮紋飾的研究發現大部分野豌豆屬的種子表現出特屬的乳突模式，從微觀形態角度將長柔毛、四籽野豌豆和法國野豌豆與其他野豌豆屬植物區分。因此顏色及紋理也可以為野豌豆屬分類鑒定提供依據。

種臍的形態特征也可作為種間分類依據[54]。Hosseinzade等[55]結合種臍顏色和形狀對伊朗野豌豆屬植物進行區分。本研究中種臍顏色變異系數達到75.12，種臍形狀變異系數次之，為35.58，種臍長變異系數最低，為28.78，種臍顏色和種臍長也表現出較高的多樣性，在本研究中均作為野豌豆屬分類鑒定的依據。馬正華等[23]的研究表明救荒野豌豆種臍顏色與本研究結果分類標準相同，窄葉野豌豆種臍同樣為白色。

胚根由于有種皮包裹，受外界環境變化的影響較小，更能反應出種質資源之間的變異。唐賽春等[56]、Hu等[57]分別強調了胚根特征在竹類植物中的分類意義。胚根長、胚根寬變異系數較高，可用于區分不同種的種子，而胚根基部斑紋、胚根尖端形狀變異較少，多樣性小，但在本研究中仍可在一定程度上用于分類鑒定。此外子葉顏色變異系數相對較小，但仍可代表部分種子特征。夏碧波等[58]研究中，子葉顏色雖然變異系數較低，但仍是引進辣椒(Capsicumannuum)資源聚類分析的重要依據。

主成分分析結果表明，所測定17個形態指標中，百粒重、種子長、種子寬、種子厚、胚根長、種臍形狀、胚根尖端形狀為主要成分，能夠代表所測的17個性狀的絕大多數信息，表明野豌豆屬種子表型遺傳變異主要來自于上述性狀。楊曉霞[59]對暴馬丁香(Syringareticulata(Bl.)Hara var.Mandshurica(Maxim.) Hara (S.AmurensisRupr.)種子形態指標進行主成分分析也表明，百粒重、種子長、種子寬均是主要形態特征。同時種臍長、種皮顏色、種臍長/種子長、胚根寬、子葉顏色等載荷也較高。張建茹[60]在研究小檗科(Berberidaceae Juss.)植物種子微觀形態及其分類學意義中表明，種子形狀和種皮紋飾的負荷量絕對值在0.7以上，具有重要分類意義。因此，本研究通過主成分分析，了解各性狀對目標性狀作用的大小，也充分說明上述指標是區分不同野豌豆屬不同種的重要依據。

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相關性分析表明反映種子大小的性狀百粒重、種子長、種子寬和種子厚相互之間有極顯著的正相關關系(P<0.01)，這與胡凌峰對花櫚木(0rmosiahenryiPrain)[61]種子的研究結果一致。當對其中某一性狀進行選擇時，其他性狀也會隨著發生變化。因此在反映種子大小的性狀中選擇其一即可用于鑒定，而百粒重變異范圍大，多樣性指數高，可作為種間分類的重要指標之一。百粒重與種臍長存在顯著正相關關系(P<0.05)。陳秀萍等[62]對龍眼(DimocarpuslonganLour.)種質資源種子形狀多樣性的調查中也得出種臍長和單果重呈顯著正相關關系，這與本次試驗結果相似。種臍長與種子長之間存在正相關關系，種子長度的增加，種臍長度隨之增加。種臍長/種子長盡管有變化，但在種內具有很高的穩定性，可以作為鑒別特征之一[36]。本研究也表明種臍長與種子長呈極顯著正相關關系(P<0.01)，相關系數為0.454，且該指標在種間具有較大變異，多樣性指數較高，是重要的鑒別特征之一。

聚類分析可以用來綜合研究不同物種及其樣本之間的性狀類型分類，能較好地反映種質材料之間的親緣關系。本研究中，部分窄葉野豌豆材料和長柔毛野豌豆為一大類，同時有窄葉野豌豆與救荒野豌豆、法國野豌豆為一大類，窄葉野豌豆也與野豌豆為一大類，四籽野豌豆和小巢菜為一大類，廣布野豌豆、大花野豌豆、大葉野豌豆、黑龍江野豌豆、歪頭菜聚為一大類。Wouw等[63]結果顯示救荒野豌豆與窄葉野豌豆在一個大類，Seahee等[64]關于野豌豆屬種子形態和微觀形態性狀的種間變異的研究中對野豌豆屬植物的分類與本研究分類相同。Castiglione等[65]的研究表明野豌豆和救荒野豌豆與蠶豆分為兩大類，但野豌豆與救荒野豌豆又分屬兩個亞類。本研究結果也表明，救荒野豌豆與野豌豆在不同大類中。

但在Seahee的研究中，山野豌豆與黑龍江野豌豆、大葉野豌豆分為不同組，四籽野豌豆和救荒野豌豆、野豌豆、法國野豌豆、長柔毛野豌都聚為一大類，與本研究不同。由于本研究收集的材料均在國內，而植物生境會造成種間變異[66-68]，因此造成分類上的差異。賈文秀[16]對山野豌豆種子生物學特性中指出不同生境下山野豌豆種子千粒重不同，生于低山丘陵地的山野豌豆千粒重較大。而本研究中的窄葉野豌豆、長柔毛野豌豆由于生境不同導致種間變異，使其形態特征的變化而歸于不同大類，還需進一部進行分類鑒定。本研究第四大類的分類與《中國植物志》中大葉野豌豆組分類相同。同時大花野豌豆、廣布野豌豆、歪頭菜和1份長柔毛野豌豆也都在這一大類中。但本研究大野豌豆不在大葉野豌豆組，而是和四籽野豌豆一組。小巢菜在《中國植物志》中屬于硬毛果野豌豆組，大花野豌豆屬于四籽野豌豆組，本研究則將小巢菜與四籽野豌豆歸于一組，大花野豌豆歸于大葉野豌豆組。

4 結論

48份野豌豆種子形態性狀表現出豐富的多樣性。形態性狀的平均變異系數為36.05%，百粒重最大，為81.92%；Shannon多樣性信息的平均值為1.82，種形指數最大，為1.94。種子長、種子寬、種子厚和百粒重相互之間呈極顯著正相關關系(P<0.01)，它們與胚根長和種臍長也呈正相關關系。相似性系數為0.79時，供試材料分為5大類群。以特征值大于1為標準提取主成分，前6個主成分累計貢獻率為86.09%。種臍形狀、種臍顏色、百粒重、種皮顏色、臍長/種子長和胚根基部斑紋可作為野豌豆屬種子的分類鑒定依據。

根據研究結果，依據百粒重、種臍顏色、種皮顏色、種皮紋理、種臍長/種子長、子葉顏色、胚根基部斑紋、種臍形狀、胚根寬/胚根長為該14種野豌豆屬植物鑒定指標制作檢索表，如下：

1a.種臍線形，種臍白色

2

2a.百粒重大于13.0 g，種皮紅褐色無斑紋，種臍長與種子長之比小于0.5

法國野豌豆

2b.百粒重小于13.0 g

3

3a.百粒重大于5.0 g，子葉顏色有橘黃色、淺黃色和米黃色，種臍長與種子長之比在0.5左右，胚根基部無黑色斑

救荒野豌豆

4

4a.胚根寬與胚根長之比大于0.9，子葉米黃色。種皮黃色有黑色花紋，胚根基部無斑紋

野豌豆

4b.胚根寬與胚根長之比小于0.9，子葉黃色，胚根基部無斑紋

窄葉野豌豆

1b.種臍棒狀，種臍不是白色

5

5a.百粒重小于1

6

6a.種臍深褐色，種皮褐色無斑紋

四籽野豌豆

6b.種臍紅褐色，種皮黃色有斑紋

小巢菜

5b.百粒重大于1 g

7

7a.種臍長與種子長之比小于0.7，種臍灰色，種皮黑色

長柔毛野豌豆

7b.種臍長與種子長之比大于0.7

8

8a.百粒重4.0～5.0 g之間，種臍褐色，種子長4.5～5.0 mm之間，種臍長與種子長之比大于0.9

大野豌豆

8b.百粒重1.0～4.0 g之間

9

9a.種臍長與種子長之比在0.7～0. 8之間，種臍顏色為黃褐色，胚根基部無斑紋

大花野豌豆

9b.種臍長與種子長之比大于0.8

10

10a.種皮黑色，種臍深褐色，種子長在3. 0～3.2 mm之間

山野豌豆

10b.種皮褐色

11

1la.種子百粒重在2.3～3.0 g之間，種臍棕色

黑龍江野豌豆

11b.種子百粒重在1.0～2.3 g之間

12

12a.胚根基部無黑色斑塊，胚根長在0.60～0.65 mm之間

廣布野豌豆

12b.胚根基部有黑色斑塊，種皮褐色

13

13a.種臍黑褐色，胚根寬與胚根長之比0.9～1. 5之間

大葉野豌豆

13b.種臍褐色，胚根寬與胚根長之比0.6～0. 9之間

歪頭菜