圈養條件下不同年齡孟加拉白虎的腸道菌群研究

蘇 凱 雷 英 金修哲 李金邦

(太原動物園，太原，030009)

腸道中的細菌菌群因物種不同而不同，也因飲食、年齡、棲息地、疾病等因素而不同[1-2]。大量研究發現[3-5]，腸道微生物區系的動態平衡與宿主的免疫、發育、營養吸收和能量代謝息息相關，在維持宿主健康方面的潛在意義日益凸顯。因此，腸道菌群研究在保護瀕危動物領域受到越來越多的關注[6-7]。He等[8]研究發現，與母乳喂養的東北虎(Pantheratigrisaltaica)幼崽相比，哺乳山羊奶的幼崽腸道內益菌較少，致病菌較多，微生物多樣性較高。Butowski等[9]發現在高蛋白、高脂肪的生紅肉日糧中添加植物性膳食纖維，可以改變家貓(Feliscatus)的糞便細菌群豐度和有機酸質量濃度。

孟加拉白虎(Pantheratigristigris，以下簡稱白虎)是孟加拉虎的白化變種，數量稀少，目前全部為人工飼養，由于其基因突變導致的高度遺傳缺陷，使其在飼養管理和繁殖育幼上存在較大難度。

通過16S rDNA測序技術對特定環境樣品中所有的細菌進行高通量測序，以研究環境樣品中微生物群體的組成，解讀微生物群體的多樣性、豐富度及群體結構，探究微生物與環境或宿主之間的關系漸成主流[10-11]。本研究通過高通量測序技術分別對圈養條件下亞成年和成年白虎的腸道菌群進行研究，旨在探明其腸道優勢菌群，分析對比不同年齡白虎腸道微生物組成的差異，為提高白虎的飼養管理水平和疾病防治能力提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

同等飼養條件下的白虎，用滅菌采樣管分別挑取10只白虎當日清晨的新鮮糞便，其中2.0—2.5歲的亞成年白虎5只，記為SAWT組；10.0—12.0歲的成年白虎5只，記為AWT組，樣品標記清楚后置于干冰上，采樣結束后全部-80℃保存。

1.2 微生物組總DNA提取

將2組樣品分別混合均勻后，利用E.Z.N.A.?Stool DNA試劑盒(Omega，USA)提取微生物組總DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。

1.3 PCR反應

采用引物341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；805R：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′；靶向擴增16S rDNA的V3—V4片段。PCR反應體系(25.0 μL)，Phusion?Hot start flex 2×MasterMix 12.5，模版DNA 50 ng，上下游引物(10 μmol/L)各2.5 μL，超純水加至25.0 μL。反應條件為，95℃預變性30 s；98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環：72℃延伸10 min。

1.4 產物純化和文庫構建

PCR產物經過AMPure XT beads(Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA)純化，Qubit(Invitrogen，USA)定量。通過擴增子池進行測序，擴增子文庫的大小和數量分別在Agilent 2100生物分析儀(Agilent，USA)和Illumina(Kapa Biosciences，Woburn，MA，USA)的文庫定量試劑盒上進行評估。

1.5 高通量測序和數據分析

樣品在Illumina NovaSeq平臺上按照制造商的建議進行測序，由LC-Bio提供。根據樣品獨特的條形碼，將配對端序列分配給樣品，并將建庫引入的條形碼和引物序列去除。使用FLASH合并匹配端讀取。根據fqtrim在特定的過濾條件下對原始讀數據進行質量過濾，以獲得高質量的clean標簽。使用Vsearch軟件對嵌合序列進行過濾，利用DADA2進行解調，得到特征表和特征序列。Alpha多樣性通過歸一化到相同的隨機序列來計算。然后根據SILVA分類器，利用每個樣本的相對豐度對特征豐度進行歸一化。Alpha多樣性用于分析樣本物種多樣性的復雜性，包括Chao1、Observed species、樣品文庫覆蓋率(goods coverage)、香農指數(Shannon)、辛普森指數(Simpson)5個指標，這些指標均由QIIME2計算得出。

2 結果與分析

2.1 白虎腸道菌群樣品測序有效數據統計

對原始下機數據進行雙端拼接、質量控制、嵌合體過濾后，進行高質量數據統計，10份白虎糞便樣得到原始序列共計834 978條；質控后的序列共計694 506條，Q20、Q30和GC比例均屬于合理區間(表1)，樣品質控后的序列長度為400—500 bp(圖1)。

2.2 亞成年和成年白虎腸道菌群的Alpha多樣性

對2組樣品結果進行Alpha多樣性分析(表2)，利用Chao1指數評估樣本中特征序列(OTU)數目多少，Chao1指數越大，特征序列數目越多，說明豐富度越高。結果中Chao1指數為70.00—277.05，表明豐富度不高；香農和辛普森數值越大，說明群落多樣性越高，均一性越好。圖2和圖3為豐富度指數和香農指數的稀釋曲線，從圖中可以看出，當測序量達到5 000時，各樣品的特征序列數目增加基本趨向平緩，說明更多的數據量只會產生少量特征序列數目，表示該試驗的測序數據量合理。亞成年和成年白虎所有樣品豐富度曲線，均已經達到平緩的走勢，這也反映了樣品量較為合理。樣品文庫覆蓋率均為1，試驗結果能很好地反應微生物群落情況。

表2 成年和亞成年白虎腸道菌群Alpha多樣性

2.3 白虎腸道菌落組成

2.3.1 菌群OUT數目組的相似性及重疊情況

通過QIIME2檢測得到亞成年和成年白虎樣品中共包含特征序列ID(OTU)877個，其中亞成年白虎特有特征序列299個；成年白虎特有特征序列353個，2組共有的特征序列225個(圖4)。

2.3.2 門水平上的菌群組成及其豐富度

圖5和圖6是根據物種豐度表和物種注釋表，默認選取豐度最高的30個物種分類，展示每個樣本以及分組的相對豐度的柱狀堆疊圖。在10組白虎的樣本中，豐富度較高的有5個菌門，其中放線菌門(Actinobacteria)在兩組樣本中所占比例最高，平均含量達45.3%，其次是厚壁菌門(Firmicutes)，平均含量為37.3%，另外，梭桿菌門(Fusobacteria)平均含量為7.9%，變形菌門(Proteobacteria)為7.1%，擬桿菌門(Bacteroidetes)僅為2.1%。

2.3.3 屬水平上的菌群組成及其豐富度

在10份白虎的糞便樣本中，柯林斯菌屬(Collinsella)所占比例最高，平均含量達43.8%，梭桿菌屬(Fusobacterium)和布勞特氏菌屬(Blautia)分別占到7.9%和7.5%，瘤胃球菌類群(Ruminococcusgnavusgroup)為7.0%，其余埃希氏菌屬-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、擬桿菌屬、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)以及狹義梭菌屬1(Clostridiumsensustricto1)、Paeniclostridium、鏈球形菌屬(Catenisphaera)平均含量都不足3.0%。圖7和圖8是將每個樣本以及分組的相對豐度進行不同形式的熱圖。圖中色塊越靠近紅色表示某份樣品對應的某一物種比例越高，反之，色塊越靠近藍色表示某份樣品對應的某一物種比例越低，圖中可以看出，亞成年白虎組的物種豐度變化更加豐富，亞成年和成年白虎組間的物種多樣性存在差異。

2.4 亞成年和成年白虎腸道菌群組間物種差異

根據樣品物種豐度表，利用LEfSe方法[12]分析并得出樣品組間進化分支圖(圖9)。圖9中不同圓圈層從內至外輻射分別代表界、門、綱、目、科、屬、種7個分類級別，各個節點代表該水平下的一個物種分類，該物種豐度越高節點越大。其中節點顏色為黃色的表示該物種在比較組中無顯著性差異，如果節點顏色為紅色則表示該物種在比較組中有顯著性差異，且該物種在紅色分組中的豐度更高，其他顏色以此類推。

LDA評分直方圖(圖10)顯示各組間具有統計學差異的生物學標志。由圖10可見，亞成年和成年白虎組間具有明顯的微生物種群差異。亞成年組的微生物種類中梭桿菌門和擬桿菌門明顯低于成年組(P<0.05)；琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)，Eggerthellaceae科未分類屬(Eggerthellaceae unclassified)，巨單胞菌屬(Megamonas)，梭桿菌屬，瘤胃球菌屬等顯著低于成年組(P<0.05)；而腸球菌屬(Enterococcus)，乳球菌屬(Lactococcus)，狹義梭菌屬2(Clostridiumsensustricto2)，乳酸菌屬(Lactobacillus)，鏈球菌屬(Globicatella)，放線菌屬(Actinomyces)顯著高于成年組(P<0.05)；其中亞成年組特有的有狹義梭菌屬2、乳球菌屬、明串珠菌屬(Leuconostoc)，成年組特有的為琥珀酸弧菌屬、Eggerthellaceae科未分類屬、氣單胞菌屬(Aeromonas)，LDA值分布柱狀圖與進化分支圖的結果是一致的。

3 討論

本研究結果表明，在門水平上，亞成年與成年白虎各樣品腸道菌群中的變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和梭桿菌門是優勢菌群，與和鳳平[13]研究基本一致，不同的是，在圈養東北虎腸道微生物組中相對豐度最高的是變形菌門(45.25%)，而本研究的孟加拉白虎菌群中，放線菌門豐度最高，為45.30%，變形菌門為7.10%。在屬水平上，本研究發現柯林斯菌屬最為優勢(43.80%)，這也與之前的相關研究[8，14]一致。

Karmacharya等[15]在對尼泊爾境內的孟加拉白虎腸道菌群研究分析后得出其豐度最高的是變形菌門(37.1%)，在其棲息地的土壤分析后也得出了相似的結果(32.9%)，這說明不同的棲息環境對動物腸道菌群有一定影響。

劉廣帥[16]在對雪豹(Pantherauncia)腸道菌群分析后也得出，多樣性最高的分別是厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門；AN等[17]在對3種圈養的肉食動物豹貓(Prionailurusbengalensis)、水獺(Lutralutra)和貉(Nyctereutesprocyonoides)做腸道微生物分析也得出豐度較高的是擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和放線菌門。由此可見，對哺乳動物尤其是肉食性動物來說，優勢菌群是相對固定的[18-20]，比例高低各有不同是由物種基因差異、年齡、動物食性以及棲息環境不同導致的[21]，同時也說明本研究的結果是合理的。

組間物種差異分析顯示：成年組白虎的梭桿菌門和擬桿菌門明顯高于亞成年白虎組(P<0.05)；在屬水平上，亞成年組的梭桿菌屬，巨單胞菌屬，Eggerthellaceae科未分類屬，琥珀酸弧菌屬，活潑瘤胃球菌屬等顯著低于成年組(P<0.05)；而乳桿菌屬，腸球菌屬，乳球菌屬，狹義梭菌屬2，放線菌屬等顯著高于成年組(P<0.05)；Deusch等[22]曾經對18、30和42周齡的幼貓(雄性16只，雌性14只)糞便的縱向研究結果發現，18周齡時微生物群落以乳桿菌屬和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)為主(平均豐度分別為35%和20%)；42周齡時最豐富的屬為類桿菌屬(Bacteroides，16%)和普氏桿菌屬(Prevotella，14%)。Peng等[23]研究發現不同年齡圈養大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)的腸道細菌組成不同，尤其是乳桿菌屬的含量老年大熊貓顯著地低于成年大熊貓。Vaiserman等[24]也曾指出不同年齡段的人腸道微生物區系在主要微生物門水平上的組成有顯著差異，放線菌門和厚壁菌門相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度減少。

綜上，當飲食和環境受到控制時，孟加拉白虎的糞便微生物群主要是由年齡決定的。隨著年齡變化，菌群的種類以及豐度都會發生相應變化，其相關功能的變化有待進一步研究。