基于高原鼠兔簡化基因組數據的微衛星引物開發

賀玉姣 胡萬軍 都玉蓉 王 婷 杜 雷 胡書立

(1.青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海師范大學生命科學學院，西寧，810008；2.青海師范大學體育學院，西寧，810008)

高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)是一種小型哺乳動物(Mammalia)，隸屬于兔形目(Lagomorpha)，鼠兔科(Ochotonidae)，鼠兔屬，主要生活在海拔3 000—5 100 m的高寒草原和高寒草甸，是青藏高原的優勢種[1]。高原鼠兔一方面在維持青藏高原的生物多樣性、草原生態系統中食物鏈的平衡等方面起到重要作用，被認為是青藏高原生態系統的關鍵種[2]。另一方面，在青藏高原的一些地區由于草地退化提高了嚙齒動物(Rodentia)生境適合度，導致高原鼠兔種群密度過高，造成鼠害[3]。通過對高原鼠兔的種群遺傳分析有助于了解該物種的種群結構，設立管理與保護單元，從而控制其種群數量[4]。而目前對高原鼠兔種群遺傳的分析大多是通過線粒體基因進行的，基于核基因的相關分析則較少[5-6]。

SSR(simple sequence repeats)又稱微衛星，是一類由幾個核苷酸(1—6 bp)組成的串聯重復DNA序列，廣泛分布于真核生物和部分原核生物的核基因中[7]。SSR標記的高突變速率通常會產生高水平的多態性，同時它還具有進化所受選擇壓力小、共顯性遺傳、易于分析、較好的重復性等特點，使其廣泛應用于遺傳多樣性、種群遺傳結構等的研究中[8]。傳統的SSR篩選方法，如富集文庫篩選法，實驗操作繁瑣，篩選效率往往較低[9]。Li等[10]通過磁珠富集法對高原鼠兔的SSR進行分析僅得到13對引物。而隨著高通量測序技術的發展，可以通過基因組、轉錄組等數據，對樣本的SSR進行分析，得到大量SSR位點[11-13]。其中，簡化基因組測序技術(RAD-seq)利用限制性內切酶對基因組 DNA 進行酶切，并對酶切片段進行高通量測序，該技術極大地降低了基因組的復雜度，不受參考基因組的限制，且測序成本低、準確率高[14]，用此方法已經在大刺鰍(Mastacembelusarmatus)、印尼虎魚(Datnioidespulcher)等動物中開發出SSR標記并應用于遺傳研究[15-16]。本研究采用RAD-seq技術對高原鼠兔的SSR信息進行分析，并進行SSR引物的開發，為基于SSR分子標記開展的遺傳多樣性、種群遺傳分析等研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣本與基因組DNA的提取

試驗所用8個高原鼠兔樣本采自青藏高原不同地區(表1)，將鼠兔腿部肌肉組織置于2 mL離心管中，并用體積分數95%的乙醇保存。

表1 高原鼠兔采樣位點信息

取約15 mg肌肉組織，用試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取基因組DNA，通過瓊脂糖檢測和NanoDrop 2000紫外分光光度計(Thermo Fisher Scientific，USA)對抽提DNA的質量和濃度進行檢測。

1.2 簡化基因組測序

取3個檢驗合格的基因組DNA樣本送至上海歐易生物醫學科技有限公司進行簡化基因組測序，所用的測序技術為Super GBS，試驗流程為：限制性酶切→連接接頭→PCR擴增→混合建庫→測序。

1.3 SSR位點信息分析與引物設計

對原始數據進行拼接、質控，然后用Stacks軟件包(v 1.34)進行聚類，根據聚類結果進行組裝過濾，得到最終的重疊群。利用MISA軟件進行SSR位點搜索，搜索標準為單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基，重復次數分別在10、6、5、5、5、5次以上，相鄰的SSR序列不少于100 bp。為了提高SSR的精度，取SSR與InDel的交集，條件為：①選取變異堿基數≥5的InDel；②InDel出現的位置位于SSR區域上下游5 bp內。然后利用軟件Primer v3.2.5.0設計SSR引物。

1.4 引物驗證

從設計的引物中隨機挑選70對引物進行合成，合成時為了減少熒光引物合成成本，在正向引物的5′端添加1個M13接頭序列。然后對8個高原鼠兔基因組DNA樣品進行RCR擴增。PCR擴增體系為20.0 μL，包含2.0 μL 10×Taqbuffer(含Mg2+)(Takara，大連寶生物)，5 U/μLTaqDNA聚合酶(Takara)0.2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，0.2 μL總DNA，用滅菌超純水補至20.0 μL。

反應參數設置為：95℃預變性8 min；95℃變性45 s，52—55℃退火45s，72℃延伸80s，35個循環；最后72℃延伸7 min。反應在伯樂熱循環PCR儀S1000(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上進行。

對擴增結果進行毛細管電泳分型，利用GeneScan v3.1.2讀取數據，并對數據進行整理、分析。

2 結果與分析

2.1 RAD-seq測序數據質量檢測

高原鼠兔DNA的RAD-seq測序共獲得原始數據2.14 Gb，對數據進行質控、過濾后得到高質量數據1.99 Gb(表2)。平均Q30(測序堿基質量值，即測序時錯誤識別的概率為0.1%、正確率為99.9% 的堿基比例)為89.11%，平均GC比例為50.47%，結果表明樣本的數據量足夠，測序數據的準確可靠性較高，GC比例正常。

表2 高原鼠兔DNA的RAD-seq基因組測序結果

2.2 簡化基因組中SSR位點信息

由表3可知，通過MISA軟件分析共檢測到7 064個SSR位點，其中完全重復型(perfect)有6 806個，占位點總數的96.35%，而復合型較少，僅有258個，占總位點的3.65%。SSR位點中，單核苷酸重復基序最多，數量為3 260個，占總位點的46.15%；其次為二核苷酸重復基序，數量為2 710個，占總位點的38.37%；三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重復基序數量分別為535、256、40個，分別占總位點的7.57%、3.62%和0.57%；六核苷酸數量最少，僅有5個，占總位點的0.07%。在完全重復型SSR位點中，六核苷酸類型重復基序平均長度最長，可達到31 bp；單核苷酸類型重復基序的平均長度最短，為12 bp。在這些SSR位點中，單核苷酸重復SSR位點中A/T為優勢基序，占該類型基序的98.22%；二核苷酸重復基序類型有11種，其中優勢基序為AG/TC，數量分別為392、433個；三核苷酸重復基序有50種，AAC/TTG為主要基序；四核苷酸重復基序的種類數在完全重復型中最多，達83種，其中AAAC/TTTG為主要基序；五核苷酸和六核苷酸的重復基序類型數量分別為30和3，主要基序分別為AAAAC/CAAAA和CCTCAC/GCAGGA。

表3 高原鼠兔簡化基因組中SSR位點信息

高原鼠兔基因組不同類型SSR位點基序的重復次數如表4所示。單核苷酸的基序重復次數主要集中在10—14次；二核苷酸基序的SSR主要集中在6—9次重復；三核苷酸基序的SSR主要為5—6次重復；四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸基序的SSR均為4次重復。

表4 高原鼠兔不同類型及不同重復次數的SSR位點基序的分布數量

2.3 多態性SSR引物的篩選

在獲得的7 064個高原鼠兔SSR位點中，通過取SSR與InDel的交集，獲得182處符合條件的SSR區域，并最終設計出90對引物。隨機選取70對引物，對8個高原鼠兔樣本DNA進行擴增，其中無條帶或主條帶不明顯的有7對，有條帶但無多態性的引物有3對，有18對引物在8個DNA樣本的檢測中僅有2種多態性，其余42對引物具有單一條帶，且多態性較好，占總檢測引物的60%，引物具體信息如表5所示。

表5 42對具有單一條帶的高原鼠兔多態性SSR引物信息

續表5

3 討論

目前SSR標記的篩選方法主要有比較基因組法、微衛星富集文庫法和基于組學的篩選法等，其中比較基因組法需要先獲取近緣種微衛星位點信息，且不能篩選出該物種特有的微衛星，而富集文庫篩選法前期需要進行SSR序列的富集及文庫構建等復雜、繁瑣的實驗操作流程[17-18]。本研究使用簡化基因組測序技術對高原鼠兔的SSR位點進行篩選，既簡化了操作流程，同時位點的篩選效率也高于磁珠富集文庫對高原鼠兔的篩選結果[10]。同為二代測序技術的轉錄組測序也被用于SSR標記的篩選中，通過轉錄組測序技術獲得的SSR位點均位于基因的編碼區，而SSR標記大多位于非編碼區，且該區域的SSR標記通常具有更高的遺傳變異，簡化基因組序列可以均勻分布在物種的基因組中，通過該技術可以獲得更多具有高變異SSR標記[19]。另外，無論與微衛星富集文庫篩選法，還是轉錄組測序技術相比，RAD-seq所需費用都更低，因此該方法是針對目標物種進行特異性SSR標記篩選的經濟、實用的方法。

在高原鼠兔的SSR位點中，數量最多的核苷酸重復基序是單核苷酸，其次是二核苷酸，這與Tóth等[20]在嚙齒類動物中發現的二堿基重復基序數量最多并不一致。同時，高原鼠兔重復基序的類型也表現出一定的偏倚性，如二核苷酸重復基序中優勢基序為AG/TC；三核苷酸中AAC/TTG為主要基序，這也與其他物種存在差異[16，21]，而重復序列的數量與類型所表現出的差異可能都與物種特異性有關。Zane等[19]認為通常不將單堿基重復序列作為微衛星位點，應排除這一類型基序，但在本研究的驗證實驗中，有7對引物擴增的單堿基重復序列表現出明顯的單一條帶以及較好的多態性。

為節省熒光引物的設計成本，在驗證實驗中于正向引物上添加了M13接頭，但該接頭有可能會對引物的結構和結合特異性產生一定影響，導致擴增的失敗[21]。同時由于驗證樣本僅有8個，使得剩余的18對引物的多態性還需要進一步驗證，但總體來說用RAD-seq來篩選SSR標記時，在隨機選取的70對引物中，成功獲得了具有特異性單一條帶，且多態性較好的引物有42對，占總數量的60%，表明具有較高的篩選效率。獲得的42對引物足夠滿足高原鼠兔遺傳多樣性，種群遺傳結構，譜系地理等問題的研究需求。