IGF1R反義非編碼RNA在肝癌中的差異化表達

謝志海，周志聰，桂 元，孫靜鋒

(1.廣州市老人院 老年病治療中心, 廣州 510000；2.江蘇省腫瘤醫院 肝膽胰外科, 南京 210013；3. 南京醫科大學第四附屬醫院 腫瘤外科, 南京 210013)

胰島素樣生長樣因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R)作為胰島素生長因子受體，其在人體發揮著重要的作用，然而，關于IGF1R基因失調對組織影響的分子機制知之甚少。在IGF1R基因內部有一條跨過啟動子，同IGF1R基因編碼方向完全相反的長鏈非編碼RNA系列[1]。同我們通常所說的長鏈非編碼核糖核酸(RNA)表達方式很不相同的是IGF1R的反義非編碼RNA在人體的乳腺組織、心肌肌纖維中呈印記表達(即父源等位基因表達，母源等位基因沉默)，國際上把該長鏈非編碼RNA命名為IGF1R反義非編碼RNA(IGF1 receptor antisense imprinted noncoding RNA, IGF1RAIN RNA)[2]。IGF1RNA反義非編碼RNA基因在乳腺腫瘤、血液系統腫瘤以及肺部腫瘤中差異化表達同腫瘤的進展關系密切[3-5]。我們通過逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)法比較IGF1RAIN RNA在肝癌癌瘤中、肝癌瘤旁組織及正常肝組織中的含量，對不同的肝癌分期及肝癌病理分期的肝癌組織中IGF1RAIN RNA含量進行比較，分析IGF1RAIN RNA含量同肝癌的關系，驗證其作為肝癌標記物的可能性。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2017年1月-2020年6月手術切除的30例肝癌的癌組織及癌旁組織，癌旁組織定義為肝癌切緣外3 cm的肝組織，其中男19例，女11例, 年齡42～71歲，中位年齡63.75歲，腫瘤直徑1.0～8.0 cm，中位直徑5.8 cm。按照中國臨床腫瘤學會(Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO)肝癌中國指南2018版臨床分期Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期12例；病理分級按WHO分級標準：高分化肝癌10例，中分化肝癌8例，低分化肝癌12例。另取同期10例肝囊腫以及6例肝血管瘤手術切除標本的切緣旁1 cm正常肝組織作為對照組。本研究經過手術單位倫理委員會批準[南京醫科大學第四附屬醫院(20200016)]，患者以及家屬簽署同意書準予用于實驗。30例肝癌患者術前均未行其他如化療、靶向、放療、免疫、中藥等治療。

1.2試劑與方法

1.2.1試劑 Tri-Reagent購自Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇、美國ABI公司Power SYBR Green PCR Mastm’mix實時PCR試劑盒及ABI 7900HT 實時PCR系統等。

1.2.2總RNA提取 (1)從液氮罐取出肝癌切除癌瘤標本，迅速轉入保持低溫的研缽中研磨直到完全成粉狀后滴注1 ml的Trizol試劑裂解組織。(2)勻漿分相：將裂解的Trizol液1 ml轉移到1.5 ml的離心管中，20 ℃靜置5 min后向其中滴加三氯甲烷200 μl，混勻后繼續靜置3 min放置于離心機中，溫度4 ℃，轉速12 000 r/min條件下離心15 min。(3)RNA 沉淀：取400 μl離心后的上層清亮液體轉移到另一只清潔干燥的EP管中，向其中滴注異丙醇400 μl，經過4 ℃條件下15 min靜置后，以10 000 r/min快速離心15 min。(4)洗滌沉淀：離心結束后摒棄上層清亮液體后注入75%的醇1 ml，上下快速甩動EP管2次，4 ℃，以12 000 r/min離心5 min，再次摒棄上層清亮液體后將剩下的EP 管放置于清潔干燥的環境中待沉淀透亮后滴加無 RNA酶水40 μl，最后獲取物保存于-70 ℃冰箱中備用。

1.2.3互補脫氧核糖核酸(cDNA)樣品合成 吸取1 μg總RNA，使用Iinvitrogen公司的M-MLV逆轉錄酶試劑盒進行反轉錄。cDNA 樣品置于-20 ℃保存，作為下一步RT-PCR的模板。

1.2.4IGF1RAIN RNA分析 實時定量RT-PCR測量肝癌切除癌瘤組織、瘤旁組織中IGF1RAIN RNA含量，根據模板或引物配置RT-PCR反應的混合液[IGF1RNA反義非編碼RNA上游引物正向序列：5’-CGACACATGGTCCAATCACTGTT-3’；IGF1RAIN RNA下游引物正向序列：5’-AGACTCCCCTAGGACTGCCATCT-3’； GAPDH正向序列：5'-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3’；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 序列：5’-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT-3’]，嚴格按照RT-PCR實驗步驟進行操作，采用探針法檢測IGF1RAIN RNA的表達值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為對照，相對表達量采用比較CT法(2-△△CT)進行數據分析。

2 結 果

IGF1RAIN RNA在肝癌癌旁組織中含量較正常肝組織低(P<0.05)；肝癌瘤體中IGF1RAIN RNA含量較正常肝和癌旁組織均顯著下降(均P<0.05)，見表1。

表1 IGF1RAIN RNA在肝癌、癌旁及正常肝組織中表達

IGF1RAIN RNA含量與肝癌者的性別、年齡以及是否有乙型肝炎史無關(均P>0.05)，但其和癌瘤的大小、癌瘤分化程度及國際抗癌聯盟(Union for International Cancer Control, UICC)肝癌分期有關(均P<0.05)，見表2。

表2 IGF1RAIN RNA在肝癌中含量分層比較

3 討 論

正常人組織中也存在癌瘤細胞，只是這些癌瘤細胞都處于靜默的G0期，只有這些靜默的癌瘤細胞啟動進入G1期才能使發生癌瘤的細胞呈幾何級增殖[6]。研究證實IGF1RAIN RNA在CD90+細胞肝癌干細胞中發揮促進肝癌增殖的作用[7-10]。我們前期通過RT-PCR法、Western-blot法檢測了5例肝癌組織中CD45-CD90+細胞內IGF1RAIN RNA，結果顯示其表達明顯低于正常肝組織，這一結果提示IGF1RAIN RNA可能參與抑制CD90+肝癌的增殖，這和IGF1RAIN RNA在其他組織來源的惡性腫瘤中表達降低的特點相一致的[11]。研究發現，在乳腺癌患者樣本中，IGF1RAIN RNA的含量和乳腺癌的增生及分期相關，IGF1RAIN RNA在內癌中含量較高，在進展期或者轉移癌中含量則較低[12]。研究發現，IGF1RAIN RNA在白血病細胞系和高風險AML患者的血液中表達下調[13]。IGF1RAIN RNA可能在癌瘤中扮演著負向阻礙機制，其高表達時可以阻礙癌瘤的發展及轉移[14]。我們通過實驗發現肝癌患者的癌瘤中含量更低，分期及分化這兩項條件相同的情況下，IGF1RAIN RNA隨著癌瘤體積增大數值更低，而與患者年齡是否大于60歲，是否為男性，是否患有乙型肝炎沒有關系，這說明IGF1RAIN RNA含量可能只和肝癌的本身惡性力有關。

IGF1RAIN RNA含量降低使得肝癌更容易發生，IGF1RAIN RNA含量正常可抑制肝癌的發展，另外，IGF1RAIN RNA含量降低失去了對肝癌侵襲力、浸潤能力的阻礙作用，IGF1RAIN RNA可抑制肝癌細胞增殖、誘導肝癌細胞分化，也可能抑制肝癌的發生發展，其可能成為肝癌的早期診斷指標之一[15]。

IGF1RAIN RNA促肝癌的機制探索還處于起步階段，更多的IGF1RAIN RNA在肝癌中的作用機制還需要深入研究，已有的研究證實IGFIR在癌瘤自分泌的信號傳遞中是一種重要的物質，肝癌的惡性程度及分期與IGF1RAIN RNA含量呈負相關，這對肝癌診斷及預后判斷可能存在臨床價值，IGFIR信號傳遞受阻后肝癌的發展及增殖同樣出現了遲滯，這可能為肝癌治療帶來新的發現[16]。IGF1RAIN RNA在肝癌組織中含量較非肝癌組織低，其正常含量下可以抑制肝癌的發展及增殖，在分化程度及腫瘤分期的統計中，IGF1RAIN RNA與分化程度呈負相關，與分期呈正相關，具體機制尚不清楚。IGF1RAIN RNA是否可以成為抑癌基因家族中的一員還需要繼續研究，其也可能是靶向抑制肝癌進展的一種新分子。