miR-130a 對 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型的保護作用及機制研究

盧偉廣 湯善華 王燦斌

骨關節炎是中老年人群常見的關節退行性病變，以關節軟骨進行性破壞、滑膜炎、骨質增生為特征，臨床上表現為關節疼痛和功能障礙。目前，骨關節炎尚無根治手段，臨床上主要進行鎮痛、改善關節功能等對癥治療，療效不佳時可進行關節清理、關節置換等外科治療[1-2]。骨關節炎的發病涉及多因素、多環節、多基因，具體機制尚不十分明確。因為關節軟骨的損傷及破壞是骨關節炎發病的重要病理特征，所以越來越多的研究開始關注骨關節炎發病過程中關節軟骨損傷及破壞的機制。

微小 RNA(microRNA，miR) 是近些年備受關注的一類非編碼小分子 RNA，在轉錄后水平調節基因表達并發揮相應的生物學作用。骨關節炎相關的研究證實，miR-130a 在骨關節炎患者軟骨中表達降低，長鏈非編碼 RNA HOTAIR 或 CIR 能夠使 miR-130a 的表達下調并抑制軟骨細胞的增殖[3-4]，提示 miR-130a 可能在骨關節炎發病過程中參與軟骨細胞損傷的調控，但 miR-130a 具體的調控作用及機制尚未明確。白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β) 是重要的促炎細胞因子，在骨關節炎發病過程中參與關節軟骨的損傷及破壞，多項骨關節炎相關的基礎研究也用 IL-1β 刺激軟骨細胞作為骨關節炎的細胞模 型[5-6]。基于此，本實驗將以 IL-1β 誘導骨的關節炎細胞模型為研究對象，分析 miR-130a 的保護作用及分子機制。

材料與方法

一、細胞

大鼠骨關節軟骨細胞 ATDC5 購自美國 ATCC 公司，液氮中冷凍保存。

二、試劑

miR-130a 及陰性對照(NC) miR、陰性對照腺病毒(Ad-NC) 及過表達 PTEN 的腺病毒(Ad-PTEN) 均購自上海吉瑪公司，腺病毒滴度為 1×109PFU / ml； miR 提取分離試劑盒、miR cDNA 第一鏈合成試劑盒、miR 熒光定量檢測試劑盒購自北京天根公司；MTS 細胞活力檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因及檢測系統均購自 Promega 公司；TUNEL(紅色熒光) 試劑盒購自上海碧云天公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司；人第 10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN) 一抗購自 Abcam 公司，磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、磷酸化 PI3K(phospho-PI3K，p-PI3K)、蛋白激酶 B(Protein kinase B，AKT)、磷酸化 AKT(phospho-AKT，p-AKT) 一抗購自 CST 公司。

三、儀器

細胞培養箱為 Thermo 公司(型號 BB15)，熒光定量 PCR 儀為 Bio-rad 公司(型號 CFX96)，顯微鏡購自 Nikon 公司(型號 MA100N)，電泳系統及凝膠成像系統購自 Tanon 公司(型號 5200Multi)。

四、方法

1.細胞培養及分組：ATDC5 細胞用含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養，每 3 天更換 1 次培養基，待細胞密度生長至 80% 后用 0.25% 胰蛋白酶消化，按照 1∶3 比例傳代。將細胞接種在培養板內并進行分組處理。

為了驗證 IL-1β 對 ATDC5 細胞中 miR-130a 表達的影響，將細胞分為 0 ng / ml IL-1β 組、1 ng / ml IL-1β 組、5 ng / ml IL-1β 組、10 ng / ml IL-1β 組。分別用含有 0、1、5、10 ng / ml IL-1β 的培養基處理。

為了驗證 miR-130a 對 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型的保護作用，將細胞分為對照組、miR-NC 組、IL-1β + miR-NC 組、IL-1β + miR-130a 組。對照組用不含藥物的培養基處理，miR-NC 組轉染 NC miR，IL-1β + miR-NC 組轉染 NC miR 后用含有 10 ng / ml IL-1β 的培養基處理，IL-1β + miR-130a 組轉染 miR-130a 后用含有 10 ng / ml IL-1β 的培養基處理。IL-1β + miR-NC 組與 miR-NC 組比較，細胞活力降低、細胞凋亡率增加，表明細胞發生損傷、骨關節炎細胞模型造模成功。

為了驗證 PTEN 在 miR-130a 減輕 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型損傷中的作用，將細胞分為 Ad-NC 組、Ad-NC + IL-1β 組、Ad-NC + IL-1β + miR-130a 組、Ad-PTEN + IL-1β + miR-130a 組。Ad-NC 組轉染 NC 腺病毒，Ad-NC + IL-1β 組轉染 NC 腺病毒并用含有 10 ng / ml IL-1β 的培養基處理，Ad-NC + IL-1β + miR-130a 組共轉染 NC 腺病毒、miR-130a 并用含有 10 ng / ml IL-1β 的培養基處理，Ad-PTEN + IL-1β + miR-130a 組共轉染過表達 PTEN 的腺病毒、 miR-130a 并用含有 10 ng / ml IL-1β 的培養基處理。

2.miR-130a 表達水平的熒光定量 PCR 檢測：用 miR 提取試劑盒提取細胞中的 miR，用 miR cDNA 第一鏈合成試劑盒將細胞中的 miR 反轉錄為 cDNA，用 miR 熒光定量 PCR 檢測試劑盒配置 PCR 反應體系，分別擴增 miR-130a 及 U6，擴增反應的程序為 95 ℃ 預變性 3 min 后按照 95 ℃ 15 s 及 60 ℃ 34 s 的循環重復 40 次，反應完成后生成循環曲線及循環閾值(Ct)，以 U6 為內參、按照公式 2-ΔΔCt計算 miR-130a 的表達水平。

3.細胞活力的 MTS 檢測：用 MTS 細胞活力檢測試劑盒對細胞進行染色，3～4 h 后將培養板放入多功能酶標儀，將波長設定在 490 nm 并測定吸光值、記錄為 A490。

4.細胞凋亡的 TUNEL 檢測：用 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒對細胞進行染色，避光孵育后 60 min 用抗熒光猝滅封片液(含 DAPI) 進行封片，在顯微鏡下觀察激發波長 550 nm、發射波長 570 nm 的綠色熒光及激發波長 364 nm、發射波長 454 nm 的藍色熒光，隨機觀察 3 個高倍視野，對綠色熒光細胞及藍色熒光細胞進行計數，按照綠色熒光細胞數 / 藍色熒光細胞數計算細胞凋亡率。

5.PTEN / PI3K / AKT 的 western blot 檢測：用 RIPA 裂解液提取細胞中的蛋白，用 BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量，取含有 30 μg 蛋白的樣本進行 western blot 檢測，將蛋白樣本與上樣緩沖液混合后加入 SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離后電轉移至 PVDF 膜，5% 脫脂牛奶封閉 PVDF 膜 1 h，1∶1000 稀釋的 PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 一抗或 1∶5000 稀釋的 β-actin 一抗孵育 PVDF 膜過夜， 1∶2000 稀釋的二抗室溫孵育 PVDF 膜 1 h，加入 ECL 顯影液并在凝膠成像系統中顯影得到 PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、β-actin 的蛋白條帶，計算 PTEN / β-actin、PI3K / p-PI3K、AKT / p-AKT 灰度值的比值作為蛋白表達水平。

6.雙熒光素酶報告基因實驗：構建野生型 PTEN 雙熒光素酶報告基因，含有野生型 PTEN 基因 mRNA 的 3’UTR，與 miR-130a 或 NC miR 共同轉染進入細胞，其后 48 h 采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定細胞中螢火蟲及海參的熒光活力，計算螢火蟲與海參熒光活力的比值作為雙熒光素酶報告基因的熒光活力；在 Targetscan 網站中進行生物信息學預測，根據預測結果將野生型 PTEN 基因 mRNA 3’UTR 中 miR-130a 結合的堿基進行突變、得到突變型 PTEN 雙熒光素酶報告基因，采用與野生型雙熒光素酶報告基因相同的方法檢測熒光活力。

五、統計學處理

采用 SPSS 21.0 軟件錄入數據，計量資料以x-±s表示，多組間比較采用方差分析、兩兩比較采用 LSD-t檢驗，P< 0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型中 miR-130a 表達的變化

與 0 ng / ml IL-1β 組比較，1 ng / ml IL-1β、 5 ng / ml IL-1β、10 ng / ml IL-1β 組 ATDC5 細胞中 miR-130a 的表達水平均明顯降低且隨著 IL-1β 濃度的增加，ATDC5 細胞中 miR-130a 的表達水平逐漸降低(P< 0.05)。

二、miR-130a 對 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型活力及凋亡的影響

熒光定量 PCR 檢測顯示，與對照組、miR-NC 組比較，IL-1β + miR-NC 組 ATDC5 細胞中 miR-130a 的表達水平明顯降低(P< 0.05)，與 IL-1β + miR-NC 組比較，IL-1β + miR-130a 組 ATDC5 細胞中 miR-130a 的表達水平明顯增加(P< 0.05)(圖 2a)。

MTS 檢測顯示，與對照組、miR-NC 組比較，IL-1β + miR-NC 組 ATDC5 細胞的 A490 水平明顯降低(P< 0.05)，與 IL-1β + miR-NC 組比較，IL-1β + miR-130a 組 ATDC5 細胞的 A490 水平明顯增加(P< 0.05)(圖 2b)。

TUNEL 檢測顯示，與對照組、miR-NC 組比較，IL-1β + miR-NC 組 ATDC5 細胞的凋亡率明顯增加(P< 0.05)，與 IL-1β + miR-NC 組比較，IL-1β + miR-130a 組 ATDC5 細胞的凋亡率明顯降低(P< 0.05)(圖 2c、2d)。

圖2 miR-130a 對 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型活力及凋亡的影響 a：4 組細胞 miR-130a 表達水平的比較；b：4 組細胞活力 A490 水平的比較；c：4 組細胞 TUNEL 染色圖；d：4 組細胞凋亡率的比較。與對照組比較，*P < 0.05，與 miR-NC 組比較，#P < 0.05，與 IL-1β + miR-NC 組比較，&P < 0.05Fig.2 Effects of miR-130a on the activity and apoptosis of osteoarthritis cell model induced by IL-1β a: Comparison of miR-130a expression among 4 groups; b: Comparison of A490 level among 4 groups; c: TUNEL staining of 4 groups; d: Comparison of apoptosis rate among 4 groups.Compared with the control group, *P < 0.05; compared with miR-NC group, #P < 0.05; compared with IL-1β + miR-NC group, &P < 0.05

三、miR-130a 對 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型中 PTEN / PI3K / AKT 的影響

Western blot 檢測顯示，與對照組、miR-NC 組比較，IL-1β + miR-NC 組 ATDC5 細胞中 PTEN 的表達水平明顯增加，p-PI3K、p-AKT 表達水平明顯降低(P< 0.05)；與 IL-1β + miR-NC 組比較，IL-1β + miR-130a 組 ATDC5 細胞中 PTEN 的表達水平明顯降低，p-PI3K、p-AKT 表達水平明顯增加(P< 0.05)(圖 3a、3b、3c)。

圖3 miR-130a 對 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型中 PTEN / PI3K / AKT 的影響 a：4 組細胞中 PTEN 表達水平的比較；b：4 組細胞中 p-PI3K 表達水平的比較；c：4 組細胞中 p-AKT 表達水平的比較。與對照組比較，*P < 0.05，與 miR-NC 組比較，#P < 0.05，與 IL-1β + miR-NC 組比較，&P < 0.05Fig.3 Effects of miR-130a on PTEN / PI3K / Akt in osteoarthritis cell model induced by IL-1β a: Comparison of PTEN expression among 4 groups; b: Comparison of p-PI3K expression among 4 groups; c: Comparison of p-AKT expression among 4 groups. Compared with the control group, *P < 0.05; compared with miR-NC group, #P < 0.05; compared with IL-1β + miR-NC group, &P < 0.05

四、miR-130a 靶向調節 PTEN 表達

Targetscan 生物信息學分析顯示，PTEN 基因 mRNA 3’UTR 中含有 miR-130a 的結合位點(圖 4a)； 與 miR-NC 組比較，miR-130a 組 ATDC5 細胞中野生型 PTEN 雙熒光素酶報告基因的熒光活力明顯降低(P< 0.05)(圖 4b)，突變型 PTEN 雙熒光素酶報告基因的熒光活力無明顯變化(P> 0.05)(圖 4c)。

圖4 miR-130a 靶向調節 PTEN 表達 a：miR-130a 靶向調節 PTEN 的生物信息學分析；b：野生型 PTEN 雙熒光素酶報告基因熒光活力的比較；c：突變型 PTEN 雙熒光素酶報告基因熒光活力的比較。與 miR-NC 組比較，*P < 0.05Fig.4 miR-130a targeted PTEN expression a: Bioinformatics analysis of miR-130a targeted regulation of PTEN b: Comparison of fluorescence activity of wild-type PTEN double luciferase reporter gene; c: Comparison of fluorescence activity of mutant PTEN double luciferase reporter gene.Compared with miR-NC group, *P < 0.05

五、過表達 PTEN 對 miR-130a 減輕 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型損傷的影響

Western blot 檢測顯示，與 Ad-NC 組比較， Ad-NC + IL-1β 組 ATDC5 細胞中 PTEN 的表達水平明顯增加(P< 0.05)；與 Ad-NC + IL-1β 組比較， Ad-NC + IL-1β + miR-130a 組 ATDC5 細胞中 PTEN 的表達水平明顯降低 (P< 0.05)；與 Ad-NC + IL-1β + miR-130a 組比較，Ad-PTEN + IL-1β + miR-130a 組 ATDC5 細胞中 PTEN 的表達水平明顯增加(P< 0.05)(圖 5a)。

MTS 檢測顯示，與 Ad-NC 組比較，Ad-NC + IL-1β 組 ATDC5 細胞的 A490 水平降低(P< 0.05)；與 Ad-NC + IL-1β 組比較，Ad-NC + IL-1β + miR-130a 組 ATDC5 細胞的 A490 水平明顯增加(P< 0.05)；與 Ad-NC + IL-1β + miR-130a 組比較，Ad-PTEN + IL-1β + miR-130a 組 ATDC5 細胞的 A490 水平明顯降低(P< 0.05)(圖 5b)。

TUNEL 檢測顯示，與 Ad-NC 組比較，Ad-NC + IL-1β 組 ATDC5 細胞的凋亡率明顯增加(P< 0.05)；與 Ad-NC + IL-1β 組比較，Ad-NC + IL-1β + miR-130a 組 ATDC5 細胞的凋亡率明顯降低(P< 0.05)；與 Ad-NC + IL-1β + miR-130a 組比較，Ad-PTEN + IL-1β + miR-130a 組 ATDC5 細胞的凋亡率明顯增加(P< 0.05)(圖 5c、5d)。

圖5 過表達 PTEN 對 miR-130a 減輕 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型損傷的影響 a：4 組細胞 PTEN 表達水平的比較； b：4 組細胞活力 A490 水平的比較；c：4 組細胞 TUNEL 染色圖；d：4 組細胞凋亡率的比較。與 Ad-NC 比較，*P < 0.05，與 Ad-NC + IL-1β 組比較，#P < 0.05，與 Ad-NC + IL-1β + miR-130a 組比較，&P < 0.05Fig.5 Effects of overexpression of PTEN on miR-130a attenuates IL-1β-induced osteoarthritis cell model injury a: Comparison of PTEN expression among 4 groups; b: Comparison of A490 level among 4 groups; c: TUNEL staining of 4 groups; d: Comparison of apoptosis rate among 4 groups.Compared with Ad-NC, *P < 0.05; compared with Ad-NC + IL-1β group, #P < 0.05; compared with Ad-NC + IL-1β + miR-130a group, &P < 0.05

討論

骨關節炎的發病機制未明、臨床缺乏有效的根治或靶向治療手段。關節軟骨細胞損傷及破壞、細胞外基質的進行性丟失在骨關節炎的發病中起重要作用，可逐步導致關節軟骨喪失彈性和強度、引起骨質增生或骨贅形成并出現關節疼痛、功能障礙等臨床表現。miR 是近些年多種骨科疾病研究的熱點，多種 miR 在骨關節炎的發病過程中存在異常表達[5-9]，其中 Sun 等[5]和 Jia 等[6]的研究均報道了 miR-130a 與骨關節炎發病過程中關節軟骨細胞損傷存在密切關系，在骨關節炎患者的軟骨細胞中 miR-130a 表達明顯下調，外源性使用長鏈非編碼 RNA 抑制 miR-130a 的表達后、軟骨細胞的增殖也受到抑制，提示 miR-130a 可能具有關節軟骨保護作用，骨關節炎發病過程中 miR-130a 表達減少會削弱其保護作用并引起軟骨細胞損傷。但 miR-130a 對骨關節炎發病過程中軟骨細胞的保護作用及分子機制仍有待進一步研究證實。

IL-1β 是與骨關節炎發病密切相關的促炎細胞因子，IL-1β 誘導關節軟骨細胞損傷是研究骨關節炎常用的細胞模型[3-4]。本研究為了闡明 miR-130a 對骨關節炎發病過程中軟骨細胞的保護作用，首先在 IL-1β 誘導的骨關節炎細胞模型中驗證了 miR-130a 表達的變化，不同濃度 IL-1β 刺激關節軟骨細胞后、miR-130a 的表達均明顯降低，與骨關節炎患者軟骨細胞中 miR-130a 表達的變化趨勢一致，提示 miR-130a 低表達可能與骨關節炎發病過程中軟骨細胞的損傷有關、外源性增加 miR-130a 的表達可能具有軟骨細胞保護作用。

細胞活力減弱、凋亡激活是骨關節炎發病過程中軟骨細胞損傷的特征，多項骨關節炎相關的細胞研究表明，IL-1β 刺激軟骨細胞后細胞活力減弱、凋亡率增加[10-12]。在本實驗中，在轉染 NC miR 的基礎上用 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型后觀察到：細胞活力減弱、凋亡率增加，與既往研究報道的 IL-1β 引起軟骨細胞活力降低、凋亡激活的結果[10-12]一致；而在轉染 miR-130a 的基礎上用 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型后觀察到：與轉染 NC miR 的 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型比較，細胞活力增強、凋亡率降低，表明 miR-130a 對 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型具有保護作用，能夠增強細胞活力、抑制細胞凋亡。

miR-130a 不僅在軟骨細胞中發揮增強細胞活力、抑制細胞凋亡的作用，在神經元缺血缺氧損傷、腎小球內皮細胞炎癥損傷中 miR-130a 能夠抑制凋亡[13-14]，在惡性腫瘤生長過程中能夠抑制癌細胞增殖活力、促進癌細胞凋亡[15-16]，并且多項研究均證實 miR-130a 通過靶向抑制 PTEN 基因來介導增強細胞活力、抑制細胞凋亡的作用。PTEN 具有去磷酸化酶的活性，能夠使 PI3K 及 AKT 發生去磷酸化并失活，抑制 PI3K / AKT 激活所介導的促進增殖、抑制凋亡作用[17-18]。在本實驗中，IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型中 PTEN 表達水平增加、p-PI3K 及 p-AKT 表達水平降低，轉染 miR-130a 后 PTEN 表達水平降低、p-PI3K 及 p-AKT 表達水平增加，表明 miR-130a 能夠在 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型中抑制 PTEN 表達并促進下游 PI3K / AKT 激活，這可能是 miR-130a 在 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型中發揮保護作用的分子機制。

miR 的生物學作用是在轉錄后水平調控基因表達，發揮調控作用的機制是與靶基因 mRNA 3’UTR 結合并促進 mRNA 降解或抑制 mRNA 翻譯，最終實現對靶基因表達的負調控。本實驗在發現 miR-130a 能夠在 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型中抑制 PTEN 的表達后，進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了 miR-130a 能夠靶向 PTEN 基因 mRNA 3’UTR，并且將 3’UTR 中 miR-130a 結合的堿基突變后、 miR-130a 不再影響雙熒光素酶報告基因的熒光活力。在此基礎上，本實驗設計了過表達 PTEN 的腺病毒，在轉染 miR-130a 的同時用過表達 PTEN 的腺病毒進行感染，在增加 PTEN 的表達后、miR-130a 在 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型中增強細胞活力、抑制細胞凋亡的作用喪失，由此證實靶向抑制 PTEN 基因表達是 miR-130a 在 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型中發揮保護作用的可能分子機制。

綜上所述，miR-130a 對 IL-1β 誘導骨關節炎細胞模型具有保護作用，靶向調控 PTEN 表達并增強細胞活力、抑制細胞凋亡是可能的分子機制，未來 miR-130a 可能成為研究骨關節炎發病機制及靶向治療手段的分子靶點。