奶牛乳房鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗

專蓋

（青海省黃南州尖扎縣措周鄉農牧業技術服務站 811200）

關于奶牛乳房炎致病菌的報道，目前已有80 余種，其中鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的發病率超過90%，是威脅奶牛乳房健康的主要病原微生物。鏈球菌屬革蘭氏陽性菌，能分泌毒素物質危害人畜健康。奶牛乳房炎鏈球菌主要包括接觸傳染性病原體（停乳鏈球菌、無乳鏈球菌）和環境性病原體（乳房鏈球菌），隨著抗菌物質的使用和濫用，造成藥物治療無效，因此，需要對不同種類鏈球菌的生物學特性和藥敏譜進行試驗分析才能選擇正確的藥物，提高治療效果，降低藥物殘留問題。本文對青海尖扎縣地區奶牛乳房炎乳房鏈球菌進行分離、鑒定和藥物敏感試驗，為合理選擇抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 培養基

普通營養肉湯培養基、鏈球菌選擇性培養基和50ml/L 兔鮮血培養基按實驗室常規方法配置。

1.1.2 病料來源

試驗所用菌株來自青海尖扎縣部分某規模化奶牛場，采集患乳房炎奶牛乳汁并分離到12 株疑似鏈球菌。

1.1.3 試驗藥物

表1 試驗藥物信息

1.2 試驗方法

1.2.1 鏈球菌的分離試驗

取12 株疑似鏈球菌接種到普通營養肉湯培養基進行鏈球菌富集，在37℃恒溫培養箱內培養18～24h，劃線接種于鏈球菌選擇性固體平板培養基，在37℃恒溫培養箱內培養12～24h，觀察菌落形態并挑取表面圓滑、邊緣整齊的單菌落到50ml/L 兔鮮血瓊脂培養基內，在37℃恒溫培養箱內培養12～24h，挑取單菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，挑取革蘭氏染色陽性且成對或有鏈狀排列的球形菌落到鏈球菌選擇性液體培養基進行純化培養。

1.2.2 鏈球菌的鑒定試驗

按常規方法對分離純化培養的12 株疑似鏈球菌分別進行糖發酵試驗（乳糖、海藻糖、麥芽糖、甘露醇）、七葉苷水解試驗、馬尿酸鈉水解試驗、過氧化氫酶試驗和CAMP 試驗[1]，觀察和記錄試驗結果。

1.2.3 鏈球菌的藥敏試驗

選擇乳房鏈球菌進行藥敏試驗：用吸管吸取50ul 乳房鏈球菌純培養液到固體平板培養基中，用L 棒涂布均勻，加蓋室溫靜置5min 待菌液干燥后，用鑷子夾取藥敏紙片到固體平板中，在37℃恒溫培養箱內培養18～24h 后觀察抑菌圈直徑。判定結果為抑菌環直徑d＞28mm 為高敏感度，抑菌環直徑20mm＜d＜28mm 為中度敏感，抑菌環直徑d＜20mm 為耐藥。

2 結果與分析

2.1 鏈球菌的分離鑒定結果

2.1.1 培養特性

分離菌株在普通營養肉湯培養基、鏈球菌選擇性固體平板培養基和兔鮮血瓊脂培養基內形成許多單一，半透明邊緣的圓形菌落，表面光滑、隆起，大型呈針尖狀。挑取單菌落進行革蘭氏染色，于光學顯微鏡下觀察，發現菌株為革蘭氏陽性鏈狀排列菌。分離菌株在鏈球菌選擇性液體培養基中培養時間過長，肉眼可見試管分層，底部沉淀，上層液體澄清。根據革蘭氏染色結果和細菌分離培養結果確定分離到的8 株菌株為疑似鏈球菌。

2.1.2 生化鑒定結果

如表2 所示，分離到的8 株疑似鏈球菌的糖發酵試驗（乳糖、海藻糖、麥芽糖、甘露醇）均為陽性；七葉苷水解試驗6株為陽性，2 株為陰性；馬尿酸鈉試驗6 株為陽性，2 株為陰性；過氧化氫酶試驗均為陰性；CAMP 結果顯示1 和10 號為陽性，2、3、5、7、8、9、11 和12 號為弱陽性，4 和6 號為陰性。結合細菌培養特性和生化鑒定結果確定檢測出3 類鏈球菌，分別為乳房鏈球菌（2、3、5、7、8、9、11、12）、無乳鏈球菌（1、10）和停乳鏈球菌（4、6）。

表2 分離菌株的生化試驗結果

2.2 鏈球菌的藥物敏感性試驗

如表3 所示，分離到的8 株乳房鏈球菌對20 種藥敏片的敏感差異度較大，對阿洛西林、氨芐西林、氯霉素、氟苯尼考、紅霉素和阿奇霉素的敏感率均超過75%，對萬古霉素、諾氟沙星和多西環素的敏感率均超過60%，對頭孢唑林、鏈霉素、新霉素敏感率較低，小于30%。其中酰胺醇類和大環內酯類藥物可有效治療治療該地區奶牛乳房炎鏈球菌。

表3 分離菌株的藥物敏感試驗結果

3 討論

通過對分離鑒定的8 株乳房鏈球菌進行20 種藥物敏感性試驗。發現對-內酰胺類（阿洛西林、氨芐西林）、酰胺醇類（氯霉素、氟苯尼考）、大環內酯類（紅霉素、阿奇霉素）藥物呈高度敏感，但對頭孢唑林、鏈霉素、新霉素具有不同程度的耐藥性，提示之前可能存在使用量過多或濫用現象。劉景喜等（2020）[2]對天津市地區奶牛乳房炎鏈球菌分離鑒定和耐藥性結果發現，乳房鏈球菌的檢出率最高，可達94.74%，這和本試驗結果一樣，乳房鏈球菌在奶牛乳房炎鏈球菌中的感染率最高，需要對乳房鏈球菌加以防治。王海燕等（2019）[3]對揚州、泰州地區奶牛乳房炎鏈球菌研究發現，該地區對卡那霉素、慶大霉素、氨芐西林和多黏菌素B 等藥物有一定的耐藥性。馬博等（2020）[4]對新疆石河子地區奶牛乳房炎鏈球菌研究發現，該地區對鏈霉素、頭孢唑啉、氨芐西林高度敏感，但對青霉素、克林霉素、萬古霉素、多西環素具有較好的耐藥性，這些結果和本研究有一定出入，可能和不同地區用藥情況不同有關。因此，筆者建議在治療乳房鏈球菌感染的乳房炎疾病時，需要結合本地區藥物敏感試驗結果再合理選擇抗菌藥物進行治療。