從獸醫(yī)化驗員技能競賽分析ELISA試驗注意事項

朱國強 陳偉 徐鴻 徐聰 孫圣福*

（1，山東省濟南市章丘區(qū)畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心 250200；2，山東省濟南市動物疫病預防與控制中心 250100；3，山東省動物疫病預防與控制中心 250100）

獸醫(yī)實驗室承擔著動物疫病檢測、診斷、動物疫情和免疫狀況監(jiān)測、動物疫病防控科學研究等職責，對動物疫病防控發(fā)揮著重要的支撐作用。獸醫(yī)化驗員作為獸醫(yī)實驗室檢測人員，操作的規(guī)范性直接決定檢測結果的正確與否。ELISA 作為獸醫(yī)實驗室常用的檢測方法，常用于口蹄疫、豬瘟等疫病的免疫效果檢測，也可用于動物疫病的病原檢測。為考核獸醫(yī)系統(tǒng)實驗室操作人員的技能，選取ELISA 作為技能考核的一項，主要考查選手對ELISA 試驗的基本操作、試驗過程中的生物安全以及對結果的判定等內(nèi)容，從考核結果看基本滿意，但也暴露了ELISA 過程中一些不容忽視的細節(jié)。

1 樣品和材料

1.1 樣品

待檢血清樣品為10 份，含陰性、弱陽性和強陽性3 個不同滴度，由國家口蹄疫參考實驗室制備，由省動物疫病預防與控制中心統(tǒng)一編號和致盲；改進型口蹄疫O 型液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所提供；酶標儀、移液器等儀器和耗材由山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院準備和提供。

1.2 判定依據(jù)

操作依據(jù)《試劑盒說明書》（改進型口蹄疫病毒O 型液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗）進行。

每份樣品滿分2 分，檢測結果與參考值一致得2 分，檢測結果與參考值誤差在±1 個滴度范圍內(nèi)得1 分，檢測結果與參考值相差超過±1 個滴度不得分。

2 結果

試驗從樣品稀釋開始，到工作液配制、測定OD 值，計算檢測數(shù)據(jù)，判定結果。主要考察選手移液加液的規(guī)范性、移液器、酶標儀的規(guī)范使用，對溫度反應條件、生物安全注意事項及對檢測結果正確性的掌握，選手ELISA 得分情況見附表。

附表 選手ELISA 得分情況

3 分析與討論

總體成績看，選手得分從68.5～97 不等，分數(shù)差近30 分，說明選手之間的差別比較大；中位數(shù)為90.5，說明至少一半的選手對于該項技能競賽結果良好。從各項得分看，選手主要扣分點集中在結果的準確性＞生物安全＞基本操作。

從結果得分情況看，選手得分分差較大，從3～27 分不等，2 位選手得分在10 分以下，結果偏離參考值較大，病毒抗原對照和陰陽性判定出現(xiàn)錯誤，這可能與操作過程不規(guī)范有關，操作不熟練，對該方法沒有完全掌握；其余選手得分均在18 分以上，僅有個別樣本的結果偏離參考值較大，大多數(shù)樣本的檢測結果與參考值相差1 個滴度以內(nèi)。

從生物安全得分情況看，大部分選手對實驗室生物安全有較高的認識，扣分點主要集中在個別選手，表現(xiàn)在試驗過程中口罩拉到口鼻以下，洗板過程中產(chǎn)生的廢液沒有倒在標識有“生物安全”的垃圾桶中。

基本操作包括工作液（洗滌液、病毒抗原工作液、底物）配制、樣本稀釋、抗原稀釋、加酶標抗體、底物、終止液，基本操作主要是移液的規(guī)范性、準確性以及洗滌酶標板后有沒有殘液，這與檢測結果直接相關。從選手操作看，主要集中在移液不規(guī)范，移液器與TiP 吸頭沒有卡緊，導致移液不準確，尤其是使用多道移液器時液面沒有處于同一水平線，個別樣本移液量不足；加同樣液體的順序沒有從低濃度到高濃度；移液器使用完沒有調(diào)至最大量程，沒有放置在移液器架上等；洗滌酶標板后，液體沒有拍干，殘留有部分液體；拍酶標板沒有垂直拍板，有一定角度，導致板孔中的液體上流入到下面的孔中，導致交叉污染。

從ELISA 本身看，該方法是一種免疫檢測中最常用的檢測方法之一，也是比較成熟的實驗室檢測方法，檢測結果受試劑、人員、儀器設備及環(huán)境溫度操作過程的影響。試劑質(zhì)量包括敏感性、特異性和重復性，試劑的運輸是否符合試劑盒要求，是否全程冷鏈，保存是否低溫保存，冰箱的溫度是否穩(wěn)定，使用前是否恢復到室溫等；人員是否經(jīng)過專業(yè)的技術培訓，培訓后是否考核上崗，上崗后是否進行過監(jiān)督；移液器、酶標儀等關鍵儀器設備是否經(jīng)過計量認證，精確度是否能達到要求等；操作過程是否嚴格按照標準或作業(yè)指導書的要求執(zhí)行。ELISA 試驗應至少但不僅限于以上因素才能做到檢測結果的客觀科學。