溫和氣單胞菌高免血清制備初探

成建 江淑容 程勇 覃嘉豪 廖長水 李堂武

（1，重慶市長壽區動物疫病預防控制中心 401220；2，重慶市長壽區畜禽品種改良站 401220；3，重慶市長壽區龍河鎮農業服務中心 401243；4，重慶市長壽區溫氏畜牧有限公司 401231；5，重慶市長水禽業發展有限責任公司 401243；6，重慶市長壽區瑞康寵物醫院 401220）

溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)，又稱威隆氣單胞菌溫和生物型(A.veroniibv.sobria)，是危害我國淡水養殖業的重要病原菌之一，能引起魚類、爬行類、兩棲類等冷血動物的出血性敗血癥[1]。80 年代以來，國外有些學者發現，由此菌引起人胃腸炎和食物中毒，隨著對腸毒素研究的深入，腹瀉病人體內檢出此菌日益增多，以后又發現其可引起人的敗血癥、腹膜炎、中耳炎、角膜炎及其他化膿性疾病，是人獸共患病原菌[2]。目前，對溫和氣單胞菌疫苗研究已有不少報道，但對溫和氣單胞菌氫氧化鋁滅活苗研究甚少。本試驗在溫和氣單胞菌滅活加入氫氧化鋁佐劑制成氫氧化鋁滅活苗，免疫家兔，制備高免血清。用凝集試驗檢測抗體效價，為該菌的免疫學檢測及防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

溫和氣單胞菌菌株、普通肉湯培養基及馬丁瓊脂培養基、甲醛、氫氧化鋁、硫柳汞、12 只1.5～2kg 非免疫家兔。

1.2 試驗器材

SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺、空氣浴振蕩器（HZQ-C 型）、冰箱（BCD—212 型）、隔水式電熱恒溫培養箱（PYX-DHS 型）、分光光度計（2100 型&UV-2100 型。

1.3 方法

（1）溫和氣單胞菌的培養:將溫和氣單胞菌接種于馬丁瓊脂培養基，28℃培養24h，然后接種單個菌落于5ml 普通肉湯28℃振蕩培養24h，最后將普通肉湯菌液倒入100ml 錐形瓶普通肉湯中28℃振蕩培養24h。

（2）溫和氣單胞菌液滅活：甲醛與菌液按0.4%的比例均勻混合在28℃振蕩培養24h，接種菌液于普通培養基28℃培養24h 檢驗是否滅活，并用分光光度計檢驗此菌液OD 值。

（3）氫氧化鋁滅活苗的制備：將氫氧化鋁佐劑和滅活菌液按1：4 的比例均勻混合制成滅活苗，分裝入無菌青霉素瓶子，4℃冰柜中保存備用。

（4）免疫：取非免疫家兔12 只，隨機分成3 組，每組4只，按下列免疫程序進行免疫。

試驗Ⅰ組：按照第1 天0.5ml、第14 天注射1.0ml、第28天注射1.5ml、第42 天注射2.0ml，分別采用頸部皮下注射氫氧化鋁滅活苗。

試驗Ⅱ組：按照第1 天1.0ml、第14 天注射1.5ml、第28天注射2.0ml、第42 天注射2.5ml，分別采用頸部皮下注射氫氧化鋁滅活苗。

對照組：同樣條件飼養，不注射。

（5）血清的分離與保存：試驗組和對照組分別在第一次、第二次、第三次免疫7d 后采取耳靜脈采血和第四次免疫14d后采取心臟采血，常溫下靜置，待血液完全凝固后置4℃冰箱過夜析出血清，按0.01%的比例加入硫柳汞防腐，充分混勻后按3ml 每瓶分裝到無菌青霉素瓶子，放置-20℃冰柜中保存備用。

（6）檢測抗原的制備：將溫和氣單胞菌接種于5ml 普通肉湯，在28℃的條件下振蕩培養24h 后，將菌液轉入盛裝有50ml普通肉湯的三角燒瓶中，在28℃的條件下振蕩培養24h 取出。加入0.2ml 甲醛于50ml 菌液中振蕩培養24h，接種菌液于普通培養基28℃培養24h 檢驗是否滅活，并用分光光度計檢驗此菌液濃度OD 值。分裝入無菌青霉素瓶子，放置4℃冰柜中保存備用。

（7）高免血清效價的測定：采用凝集試驗檢測血清效價。

待檢組：0.5%苯酚生理鹽水50ul 加被檢血清50ul 按照1：2，1：4，1：8.1：16……1：4096 的比例進行稀釋，最后一孔棄去50ul，再加上50ul 抗原。

抗原對照組：分別加0.5%苯酚生理鹽水50ul 與抗原50ul。

陰性對照組：分別加被檢血清50ul 與抗原50ul，3 組均在37℃下20min 觀察結果。

2 試驗結果

（1）本試驗所制備的疫苗和檢測抗原均無細菌生長，因此，本試驗制備的疫苗和檢測抗原已滅活。

（2）本試驗制備的疫苗和檢測抗原OD 值在波長540nm 調整為1 (OD 值為1 細菌個數約為1×1010/ml)。

（3）高免血清效價結果：各組分別在第一次、第二次、第三次免疫后7d 檢測抗體效價和第四次免疫后14d 檢測抗體效價。經4 次免疫后試驗Ⅰ組抗體效價為1：1024，試驗Ⅱ組抗體效價1：512，對照組沒有檢測到抗體效價。具體結果見表1、表2。

表1 試驗Ⅰ組抗體效價結果

表2 試驗Ⅱ組抗體效價結果

結果判定：用“+”表示反應強度。

#：液體完全透明，菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底,振蕩時，沉淀物呈片狀、塊狀或顆粒狀。

+++：液體略呈混濁，菌體大部分被凝集沉于管底，振蕩時情況如上。

++：液體不甚透明，管底有明顯的凝集沉淀，振蕩時有塊狀或小片絮狀物。

+：液體透明度不明顯或不透明，有不甚顯著的沉淀或僅有沉淀的痕跡。

-：液體不透明，管底無凝集，有時管底可見有一部分沉淀，但振蕩后立即散開呈均勻混勻。

3 分析討論

（1）本試驗用溫和氣單胞菌氫氧化鋁滅活苗免疫家兔制備高免血清，采用凝集試驗檢測溫和氣單胞菌抗體效價。采用兩種不同的免疫程序進行4 次免疫后，無菌分離血清，測得試驗Ⅰ組溫和氣單胞菌的效價為1∶1024。試驗Ⅱ組溫和氣單胞菌的效價為1∶512。對照組沒有檢測到溫和氣單胞菌抗體。從本試驗看，溫和氣單胞菌滅活苗能刺激家兔機體產生抗體，本試驗采用的免疫方法可以使這些物質刺激機體產生抗體。

（2）從試驗結果可以看出，試驗Ⅰ組的效價比試驗Ⅱ組效價高，而試驗Ⅱ組的免疫劑量比試驗Ⅰ組免疫劑量大。按照常理是抗原劑量越大抗體滴度越高，存在這一結果的原因可能有家兔個體生理差異；試驗Ⅱ組的免疫劑量可能過大。

（3）在實際生產中以往對溫和氣單胞菌的分離鑒定多采用生化實驗，操作技術煩瑣，項目多達幾十種，鑒定成本高昂，且觀察時間較長，常給實驗診斷帶來困難[3]。溫和氣單胞菌高免血清的制備為該菌的免疫學檢測及防治提供依據。

（4）目前，檢測抗體的方法很多，如血凝及血凝抑制試驗、免疫熒光試驗、血清中和試驗等。但用96 孔“U”形微量反應板上進行凝集試驗所需設備簡單，操作方便、易行，凝集現象明顯，易于觀察。于是本次試驗在96 孔“U”形微量反應板上進行凝集試驗檢測血清抗體效價。

4 結論

從本試驗看，溫和氣單胞菌制備滅活苗后免疫家兔能產生抗體。試驗Ⅰ組的免疫劑量明顯小于試驗Ⅱ組，而試驗Ⅰ組的效價為1：1024，試驗Ⅱ組的效價為1：512，試驗Ⅱ組效價明顯小于試驗Ⅰ組效價，因此，我們認為試驗Ⅰ組的注射劑量更適合免疫。