雌激素受體α介導氧化磷酸化通路在肺癌發生中的作用

曾卓穎，吳德生，魯晶晶，廖 慧，賴洪飄，袁建輝，*，胡章立，*

(1．深圳大學生命與海洋科學學院，廣東 深圳518060；2．深圳大學物理與光電工程學院，廣東 深圳518060；3．深圳市南山區疾病預防控制中心，廣東 深圳518054；4．深圳市疾病預防控制中心，廣東 深圳518055)

據最新統計，全世界肺癌的預估死亡數占癌癥總死亡數的22%，是預估死亡比例最高的癌癥。肺癌發生過程中涉及的具體分子機制仍不完善，近年來不少研究發現線粒體功能紊亂在癌癥發生中發揮重要作用。線粒體功能改變引起能量代謝的變化可增強腫瘤細胞的遷移能力。腫瘤細胞會條件性的給線粒體下達自噬指令，自噬后產生的碎片促進腫瘤細胞的生長。在面對化療、放療和自身免疫細胞攻擊時腫瘤細胞總是展現出驚人的恢復能力，這跟腫瘤細胞產生的相關蛋白保護線粒體的能量代謝能力密切相關。線粒體缺陷引起的能量代謝途徑改變是腫瘤發生的重要途徑之一。腫瘤細胞為了維持和滿足其特殊需求，能量代謝與正常細胞有較大差異，主要體現在氧化磷酸化途徑和有氧糖酵解途徑之間的轉化。越來越多的科研人員希望通過找到腫瘤靶向能量代謝通路中的關鍵分子，從而達到控制腫瘤。有研究發現雌激素受體α(estrogen receptor α，ESRRA)參與調控能量代謝，在多種腫瘤中發揮重要作用，但是其涉及的具體機制還不夠完善。基于此，本文旨在探討ESRRA在肺癌中的作用及可能涉及的能量代謝分子調控機制。

1 材料與方法

1.1 差異基因的表達分析

利用UALCAN在線平臺(http://ualcan.path.uab.edu/)分析人肺癌組織(包括肺腺癌和肺鱗癌)及其癌旁正常肺組織中

ESRRA

基因的表達變化，參數設置選擇系統默認，表達水平數據采用R語言的ggplot2包進行箱型圖的繪制。

1.2 生存分析

Kaplan-Meier能夠評估5.4萬個基因(mRNA、miRNA、蛋白)對21種癌癥，包括肺癌(

n

=3 452)生存率的影響，數據的來源包括GEO、EGA和TCGA數據庫。我們利用Kaplan-Meier Plotter數據庫(http://kmplot.com/)對肺癌中

ESRRA

及其富集在氧化磷酸化通路中的 相 關 基 因

ATP5B、ATP5G3、COX5A、COX8A、SDHD、UQCRC1

和

UQCRC2

表達進行生存分析。

1.3 GO和KEGG通路富集分析

利用GEPIA2在線分析平臺(http://gepia.cancerpku.cn/)獲得與ESRRA表達模式相似的前50個基因。在GeneMANIA在線分析平臺(http://genemania.org/)上構建這50個基因的蛋白質-蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction，PPI)。隨后利用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對這50個基因進行功能注釋，主要包括生物學進程、細胞組分和分子功能，并進行KEGG通路富集分析。參數采用系統默認設定，導出的功能注釋和富集分析數據采用R語言進行處理以及運用ggplot2包進行條形圖的繪制。

1.4 表達水平相關性分析

利用TIMER 2.0在線平臺(http://timer.compgenomics.org/)在肺癌組織中進行

ESRRA

基因表達水平之間的相關性分析，采用斯皮爾曼系數(ρ)表示基因表達水平間的相關性。

1.5 Western blot驗證分析

采用Western blot驗證ESRRA蛋白在正常人支氣管上皮細胞(16HBE)、人肺腺癌細胞(NCI-H1975)和人肺鱗癌細胞(SW900)中的表達變化，方法體系參考本課題組前期發表的論文。ESRRA抗體購自Abcam公司；β-actin抗體購自Santa Cruz公司；兔二抗和鼠二抗均購自Thermo公司。ESRRA一抗的稀釋比例為1∶1 000，β-actin一抗、兔二抗和鼠二抗的稀釋比例均為1∶3 000。所得蛋白條帶圖運用Quantity One軟件進行灰度值測定，所有實驗重復4次，測定的灰度值采用

x

ˉ±

s

表示。應用R軟件進行統計分析和繪圖，采用配對

t

檢驗進行組間差異分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 ESRRA基因在肺癌中的表達及生存分析

TIMER 2.0在線平臺分析的結果顯示：數據樣品來源于TCGA數據庫，與肺腺癌癌旁正常肺組織(

n

=59)相比，

ESRRA

基因在肺腺癌組織(

n

=515)中高表達，差異有統計學意義(

P

＜0.01)；與肺鱗癌癌旁肺組織(

n

=51)相比，

ESRRA

基因在肺鱗癌組織(

n

=501)中高表達，差異有統計學意義(

P

＜0.01)，見圖1A。生存分析結果顯示，

ESRRA

基因表達水平高的肺癌患者總體生存率、無進展生存率和進展后生存率等指標均顯示較差的預后，差異均有統計學意義(

P

＜0.05，圖1B～圖1D)。

圖1 ESRRA基因表達水平及生存分析

2.2 與ESRRA表達模式相似基因的功能注釋及KEGG通路富集分析

PPI分析結果如圖2所示，顯示50個與

ESRRA

有著相似表達模式的基因，它們編碼的不同蛋白及其相互作用蛋白中，我們發現67.98%表現出相似的共表達，11.36%具有物理相互作用特性，10.64%存在共定位，7.52%為預測蛋白。其他結果包括共享蛋白結構域、通路和遺傳相互作用。

圖2 蛋白相互作用分類注釋圖

通過GO分析這50個與

ESRRA

有著相似表達模式基因的基礎功能。結果見圖3，顯示在生物學進程方面，這些基因主要涉及線粒體組織、三羧酸循環、氧化磷酸化、線粒體電子轉運。在細胞組分方面，這些基因主要涉及線粒體內膜、線粒體、髓鞘、細胞表面的微絨毛和刷狀緣；在分子功能方面，這些基因主要涉及電子載體活動、轉移酶活性，轉移含磷基團、肌酸激酶活性和質子轉運ATP合酶活性，旋轉機制。

圖3 基因本體(GO)分析

KEGG通路富集的結果顯示：這些基因主要富集在代謝通路和氧化磷酸化通路(圖4)。其中氧化磷酸化通路被包含在代謝通路中(圖5)，所以后續主要分析氧化磷酸化通路中的核心基因。

圖4 KEGG通路富集分析

圖5 基因富集在氧化磷酸化通路中的位置

2.3 氧化磷酸化通路核心基因與ESRRA的相關性分析

氧化磷酸化通路核心基因與

ESRRA

表達水平的斯皮爾曼相關性分析結果見圖6，顯示在肺腺癌組織中，

ESRRA

的表達水平分別與

ATP5B、COX5A、COX8A、UQCRC1

和

UQCRC2

基因的表達水平呈正相關(相關系數分別為0.197、0.215、0.446、0.186和0.104，均為

P

＜0.05)；在肺鱗癌組織中，

ESRRA

的表達水平分別與

ATP5B、ATP5G3、COX8A、SDHD

和

UQCRC1

基因的表達水平呈正相關(相關系數分別為0.200、0.124、0.518、0.132和0.132，均為

P

＜0.05)。

圖6 氧化磷酸化通路核心基因與ESRRA表達水平的相關性分析

2.4 氧化磷酸化通路核心基因的表達水平及生存分析

與正常肺組織相比，

ATP5B

、

ATP5G3

、

COX5A

、

COX8A

、

SDHD

、

UQCRC1

和

UQCRC2

基因在肺腺癌組織和肺鱗癌組織中均高表達，差異均有統計學意義(

P

＜0.05)，見圖7。

圖7 氧化磷酸化通路關鍵基因的表達分析

生存分析的結果見圖8，顯示

ATP5B、ATP5G3、COX5A

、

COX8A

表達水平高和

SDHD

表達水平低的患者在肺癌總體生存率中均顯示出較差的預后，差異均具有統計學意義(

P

＜0.01)，而

UQCRC1

和

UQCRC2

的表達水平與肺癌的總體生存率無明顯相關關系。

圖8 氧化磷酸化通路核心基因的總體生存率分析

2.5 Western blot驗證ESRRA蛋白在肺癌細胞中的表達

Western blot檢測結果如圖9所示，與正常人支氣管上皮16HBE細胞相比，ESRRA蛋白在人肺腺癌NCI-H1975細胞和人肺鱗癌SW900細胞中的表達均上調(

P

＜0.01)。

圖9 Western blot檢測ESRRA蛋白在肺癌細胞中的表達

3 討論

隨著高通量分析技術的不斷革新，組學分析成本日益降低。越來越多的數據庫可供選擇進行相關生物信息學分析。我們發現

ESRRA

基因在肺腺癌和肺鱗癌組織中均呈現高表達，且表達水平高的

ESRRA

顯示了較差的肺癌預后。這一結果提示，ESRRA可能是促進肺癌發生的關鍵分子。我們進一步發現與

ESRRA

基因表達模式相似的基因與線粒體功能密切相關，且主要富集在氧化磷酸化通路。富集在氧化磷酸化通路中的基 因 包 括

ATP5B、ATP5G3、COX5A、COX8A、SDHD、UQCRC1

和

UQCRC2

。線粒體是細胞的代謝中心，而腫瘤細胞具有異于正常細胞的代謝特征。當線粒體功能發生紊亂時，能量代謝途徑隨之發生異常變化。這些異常變化涉及癌基因激活、抑癌基因失活、細胞凋亡異常和DNA損傷修復阻滯，最終促進了腫瘤的發生。相關性分析的結果顯示在肺癌(包括肺腺癌和肺鱗癌)組織中

ESRRA

的表達與

ATP5B

和

COX8A

的表達水平呈正相關，

ATP5B

和

COX8A

的表達在肺腺癌和肺鱗癌組織中均呈現高表達，且表達水平高的

ATP5B

和

COX8A

顯示出較差的肺癌預后。在真核細胞中ATP合酶亞基β(

ATP5B

)作為細胞能量代謝過程中氧化磷酸化通路上的重要分子參與催化ATP合成的限速反應。線粒體DNA編碼環狀RNA與

ATP5B

相互作用，抑制線粒體活性氧的輸出，進而引發細胞相關功能異常。氧化磷酸化通路中

ATP5B

表達升高導致線粒體產生活性氧成分，進而促進炎癥小體的產生和激活，這是腫瘤術后復發的重要原因之一。細胞色素c氧化酶亞基VIIIA(

COX8

)編碼的蛋白質是呼吸鏈的末端酶，它將電子從細胞色素c轉移到氧分子，并伴隨著質子電化學梯度的產生穿過線粒體內膜，其缺失可導致能量代謝紊亂進而發生病變。綜上所述，

ESRRA

表達水平升高可能介導氧化磷酸化通路中關鍵分子ATP5B和COX8A的表達上調，進而引起細胞能量代謝紊亂，促進肺癌發生。本研究為進一步研究ESRRA調控線粒體功能在肺癌發生發展中的作用提供了理論基礎，為肺癌的科學防治提供了新的藥物靶標。