用7種醫療用品原料比較家兔肌肉植入試驗兩種評價方法的檢測敏感性

趙 霞，黃雅理，高顯己，王 穎，孫會敏*，林 飛*

(中國食品藥品檢定研究院，北京100050)

家兔肌肉植入試驗是將檢測樣品直接埋植于兔肌肉群中，在植入后不同時間觀察組織反應的進程和演變，比較檢測樣品與對照樣品的生物相容性，進行毒理學安全性評價。目前越來越多地用于體內埋植或注射等臨床給予途徑的新醫療器械和醫療用品原料的評價，而且一般用途均屬于較高風險，需要采取特別措施嚴格控制管理以保證其安全性，臨床前均按照國家標準(GB/T 16886.6)和國際標準化組織(ISO 10993-6)文件要求進行植入試驗。但上述標準中對樣品處理、植入方法和時間、觀察判定方法等有不少可變條件，選擇較高標準的試驗條件對試驗結果的準確判定意義重大。因此本實驗室在應用該試驗方法檢測的樣品中，選擇顆粒、薄膜等7種不同產地的醫療用品原料，進行短期、中期和長期植入體內后的檢測與評價，同時比較不同植入時間、不同觀察方法的敏感性和可信性是否有差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣品

選擇不同材料、規格、產地的7種醫療用品原料，對照樣品選擇已應用于臨床多年的進口原料，見表1。

表1 7種醫療用品原料相關情況

1.1.2 實驗動物

清潔級新西蘭白兔共84只，雄性，體質量2.4～3.0 kg，每種檢測樣品使用12只。源于中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，實驗動物生產許可證SCXK(京)2019-0017號。實驗動物使用許可證SYXK(京)2017-0013號，兔在實驗動物室適應觀察1周后進行實驗。

1.1.3 主要儀器

本研究使用的主要儀器包括：蒸汽滅菌器、電子天平、電熱恒溫干燥箱、組織病理學設備、生物顯微鏡、大視場工作儀、電動剃刀和手術燈。

1.1.4 主要器械與試劑

實驗使用下列器械與試劑：不銹鋼2號標準篩(孔徑850 μm)、10 mL注射器、醫用剪刀、鑷子、手術刀、止血鉗、縫合針、絲線、3%戊巴比妥鈉溶液、2%碘酊、75%乙醇溶液和10%甲醛溶液等。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

根據檢測樣品的形狀不同，薄膜裁剪成長×寬=10 mm×3 mm；體積小于長×寬×高=10 mm×5 mm×3 mm的樣品顆粒不需切剪。肉眼挑選均勻一致、周邊沒有銳角的作為植入樣品，清洗、過濾、烘干，放置在玻璃平皿中，經高壓滅菌(溫度113℃、壓力0.060 MPa、20 min)處理后用于試驗。

1.2.2 手術植入

電動剃刀去除兔腰背部以下脊柱兩側被毛，面積為15 cm×20 cm。3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，在脊椎兩側2.0～3.0 cm處，從第12胸椎至第5腰椎設4個植入點，每點間隔2.5 cm，深約1.5 cm，左側植入檢測樣品，右側植入對照樣品。

1.2.3 術后觀察

植入后連續觀察5 d植入點的皮膚反應，有無出血、紅腫、樣品顆粒移位或脫落等，第7天拆除切口縫合線。術后第15、30、60和90天分別稱取每只動物體質量，每天觀察動物整體狀態，是否出現異常反應或瀕死狀態。

1.2.4 解剖觀察

植入后第15天(2周以上)、30天(4周以上)、60天(8周以上)和90天(12周以上)分別處死3只兔，切取包裹樣品周圍1.0～1.5 cm的肌肉組織，中間切開，暴露植入樣品，大體觀察植入部位組織有無異常病變；經固定、包埋、切片、染色后，每只兔檢測樣品組和對照樣品組4個植入點各制備3張切片。

1.2.5 組織反應病理學分級

生物顯微鏡高倍鏡觀察4個植入點各1張切片的囊腔壁炎癥反應和肉芽形成程度，以及檢測樣品在植入組織中的形態學改變。觀察最典型一個視野中纖維化囊腔壁厚度，新生血管形成、脂肪細胞浸潤數量和炎性細胞數量及種類，進行統計分級。分級標準見表2。

表2 植入樣品周圍組織反應分級

1.2.6 組織反應半定量評價計數

生物顯微鏡高倍鏡觀察4個植入點各3張切片，計數一個視野中囊腔壁的炎性反應個數×2(包括嗜中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及壞死細胞數量等)和組織反應(包括新生血管形成個數、纖維化厚度、脂肪細胞浸潤個數等)。計算檢測樣品平均數值與對照樣品平均數值的差值。

1.2.7 級別和分值判定

每組3只兔檢測樣品組與對照樣品組的平均分值比較，組織反應級別相同或平均分值的差值在0～2.9數值范圍為無刺激；組織反應級別相差Ⅰ個等級或平均分值的差值在3.0～8.9為輕度刺激；組織反應級別相差Ⅱ個等級或平均分值的差值在9.0～15.0為中度刺激；組織反應級別相差Ⅲ個等級或平均分值的差值＞15.0為重度刺激。

2 結果

2.1 一般狀況觀察

植入后第1～5天觀察各植入點切口無出血、樣品在植入腔內無排出，皮膚無紅腫。在植入各時間范圍內動物精神好，外觀及行為正常，活動自如，未見明顯異常反應或瀕死狀態。

2.2 體質量增長

選擇植入90 d組各檢測樣品3只兔平均體質量見表3。植入后至取材前各時間點兔平均體質量增長基本正常，未發現各檢測樣品對兔的體質量產生明顯影響。

表3 兔植入樣品各時間點體質量增長觀察

2.3 大體觀察

在植入檢測樣品后第15、30、60和90天各組動物分別處死3只，手術暴露植入樣品，其植入部位組織未見血腫、水腫、炎癥和明顯囊腔纖維化等病變；檢測樣品和對照樣品顆粒大小和形態與植入前基本一致，未見降解和吸收。

2.4 組織反應分級

顯微鏡觀察7種檢測樣品和對照樣品每個植入點1張切片，根據炎癥反應和纖維囊腔形成的程度和數量其進行組織反應分級，發現檢測樣品在植入后第15天存在炎癥反應II級6個，纖維囊腔II級3個；植入后第30天存在炎癥反應II級4個，纖維囊腔II級3個；植入后第60天存在炎癥反應≥II級4個，纖維囊腔≥II級3個；植入后第90天存在炎癥反應II級1個，纖維囊腔≥II級2個(見圖1)。與對照樣品比較，組織反應級別相差Ⅰ個等級有輕度刺激性的是植入后第60天的3號樣品以及植入后第90天的3、5號樣品(見表4)。

圖1 顯微鏡觀察植入部位肌肉組織纖維囊腔形成和炎癥反應分級

表4 7種檢測樣品植入不同時期組織反應分級

2.5 半定量評價計分

顯微鏡觀察7種檢測樣品和對照樣品植入點的炎性反應和組織反應，計算平均分值的差值，發現植入后第15天均＜2.9，為無刺激性；植入后第30天5號樣品為4.5，為有輕度刺激性；植入后第60天3、4、6號樣品為6.4、3.0、3.2，有輕度刺激性；植入后第90天3、5號樣品為7.5、3.2，有輕度刺激性(見表5～表8)。

表5 7種檢測樣品植入第15天半定量評價分值統計

表8 7種檢測樣品植入第90天半定量評價分值統計

2.6 各植入時間點組織病理學比較

檢測樣品植入第15天，樣品周圍組織反應主要是炎性細胞浸潤和水腫為主，成纖維細胞和毛細血管構成的肉芽組織和少量脂肪細胞；植入后第30天，樣品周圍肌肉組織和結締組織處于快速修復狀態，新生毛細血管中度增生，炎性細胞浸潤和水腫明顯好轉；植入后第60～90天，樣品周圍肌肉組織和結締組織呈穩定狀態，新生毛細血管逐漸消失，脂肪細胞浸潤增加，炎性細胞浸潤和水腫基本消失(見表9)。

表6 7種檢測樣品植入第30天半定量評價分值統計

表7 7種檢測樣品植入第60天半定量評價分值統計

表9 非降解吸收樣品對各植入期的組織病理學反應特點*

3 討論

對醫療用品原料進行生物相容性評價時，一般采用中華人民共和國國家標準GB/T 16886.6和國際標準化組織ISO 10993-6等規范要求進行。國家標準GB/T 16886.6-2015版與GB/T 16886.6-1997版 相比，主要采用ISO 10993-6：2007版內容，增加了附錄E半定量分值評價法的具體實施細則，對植入樣品數量、觀察切片數量、可降解/可吸收材料應用、判定標準及打分細則等均作了明確規定。但仍保留了國家標準GB/T 16886.6-1997版組織反應分級法相關內容。兩種檢測方法在判定檢測樣品時，結果是否一致，哪個更敏感、可信度更高，是本研究關注的內容。

本研究結果表明，組織反應分級法檢出有輕度刺激性的是植入后第60天的1個樣品，植入后第90天的2個樣品；半定量分值評價法檢出有輕度刺激性的是植入后第30天的1個樣品，植入后第60天的3個樣品，植入后第90天的2個樣品。其敏感性明顯提高、檢出率明顯增加，其原因主要是后者將炎細胞分類更細致且明確，計數的分數值放大了2倍(分值×2)，判定刺激性平均分值的差值范圍標準固定，每只動物植入點顯微鏡觀察由3～4張切片增加到10～12張切片，切片數增加可減少平均分值個體誤差，更具有代表 性。由此顯示半定量分值評價法其檢出率增加、敏感性、可信性提高，更能確切反應出受試樣品與肌肉組織生物相容性的刺激程度。

樣品植入周期的設計要充分考慮材料特性和體內滯留期的長短，確保植入物在體內生物學組織反應達到穩定狀態，以完整評價其生物相容性。對7種檢測樣品和對照樣品分別植入到兔同體左側或右側脊柱旁肌，進行短期15和30 d、中期60 d和長期90 d術后觀察，通過組織病理學觀察、分級、半定量計分，評價周圍組織的反應程度。結果顯示植入后第15天，樣品周圍組織反應主要是炎性細胞浸潤和水腫為主，與手術切口的大小、無菌操作、愈合恢復狀態密切相關，區分創傷反應和植入物刺激反應較困難，檢出假陰性和假陽性率較高。植入后第60天觀察，樣品周圍肌肉組織和結締組織呈穩定狀態，炎性細胞浸潤和水腫基本消失，新生毛細血管逐漸消失，脂肪細胞浸潤增加，纖維囊腔存在輕微～輕度增生。檢測樣品如存在刺激性，其炎癥反應和纖維囊腔形成明顯加重，檢出率和可信性相對提高。

金屬材料、高分子材料、陶瓷材料以及復合材料等在臨床上用途廣泛。原材料的風險性定位分為低度風險、中度風險和高度風險。人工器官、血管支架、血管內導管、植入器材、手術黏合劑、封堵劑、一次性輸液器、輸血器，注射用內包裝等屬于高度風險材料，需要進行多項毒理學試驗以及嚴格安全性審評才能進入臨床，而動物植入試驗是仿照臨床給予途徑、接觸部位和接觸時間，評價其局部刺激和全身毒性反應，目前該試驗更傾向與亞慢性毒性試驗或慢性毒性試驗結合，增加劑量(體積或數量)、增加全身檢測項目(血液學、生化學、組織臟器等)，以滿足生物材料和生物功能對不同患者自我康復能力，實現病變或缺損組織及器官的永久修復。