食管鱗癌中SERPINE1 mRNA的表達及其臨床意義

常晨，楊荔艷，蔡洪慶，苑青，郝佳潔*，王明榮*

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院，分子腫瘤學國家重點實驗室，北京100021)

食管癌是我國主要的惡性腫瘤之一，發病率居第6位，病死率居第4位。根據病理類型不同，食管癌可分為鱗癌和腺癌兩種常見亞型，在中國，食管鱗癌是最主要的病理類型，占90%以上。食管癌的5年生存率總體較低，國家癌癥中心的數據顯示，2018年我國食管癌的5年生存率為33.0%。因此，探索食管癌的分子改變，尋找預后相關的分子標志及潛在治療靶點對改善食管癌患者的生存尤為重要。

SERPINE1

基因定位于7q22.1，共9個外顯子，是絲氨酸蛋白酶抑制因子超家族成員。既往的研究發現，這個分子在腫瘤中的作用包括促進細胞侵襲轉移、維持增殖信號、抗凋亡和誘導血管生成等。Sakakibara等發現在食管鱗癌轉移患者的腫瘤組織中SERPINE1的表達升高，且其高表達的患者生存率較低，因此提示其可能作為食管鱗癌預后的標志物。RNAscope作為一項新的用于檢測細胞中目標RNA的原位雜交(

in situ

hybridization，ISH)技術，近些年來越來越多地被應用于腫瘤研究領域。該項技術的操作流程簡單、靈敏度和特異性高于傳統的熒光原位雜交方法，具有向臨床應用推廣的潛力。本研究使用RNAscope技術檢測了236例食管鱗癌中SERPINE1 mRNA的表達情況，并分析了其與臨床病理指標及預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 公共數據庫分析

從基因表達庫(Gene Expression Omnibus，GEO)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載GSE20347微陣列的數據集，比較SERPINE1 mRNA在正常組織和腫瘤組織中的表達情況。從基因組圖譜(The Cancer Atlas，TCGA)數據庫(https://www.cancer.gov)下載81例食管鱗癌組織的SERPINE1 mRNA表達數據和臨床病理參數信息，從中提取出SERPINE1 mRNA的每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM)值，將其與T分期、淋巴結轉移、腫瘤分級、疾病分期和生存時間等信息進行相關性分析。

1.2 病例與標本

本研究共收集食管鱗癌手術切除及其配對切緣形態學正常的癌旁組織236例，均來自2011—2012年河南省林州腫瘤醫院。標本為完成臨床診斷后取得的剩余組織，且所有患者均已簽署知情同意書。標本取材后按照常規步驟進行福爾馬林固定和石蠟包埋。該項研究的設計和開展經過中國醫學科學院腫瘤醫院倫理委員會批準(No.12-097/631，16-084/1163)。

以組織病理學的檢查為確診標準，根據第7版美國癌癥聯合委員會癌癥分期手冊進行分期。總生存率定義為手術后一段時間內死亡個體的百分比。隨訪至少5 a，入組患者均有完整的隨訪信息。

1.3 組織芯片-SERPINE1 mRNA原位雜交檢測

每個病例選取3個癌組織點和2個手術切緣正常的癌旁組織點，本室自行制作食管癌組織微陣列(tissue microarrays，TMAs)，并制備4 μm切片備用。采用RNAscope原位雜交技術對食管癌樣本進行檢測，RNAscope探 針購 自 美 國ACD公 司(764～1 752 bp，RNAscopeProbe-Hs-SERPINE1)。原位雜交按照RNAscope 2.5 HD Reagent Brown檢測試劑盒的說明書進行。主要步驟如下：切片脫蠟，雙氧水處理，靶標修復試劑處理，蛋白酶處理，RNAScope探針雜交及放大處理，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，封片。實驗結果使用NanoZoomer(Hamamatsu公司，日本)病理掃描儀進行掃描，并由兩位研究者獨立進行雙盲評分。

1.4 結果判斷

SERPINE1 mRNA信號評分采用半定量法，即染色強度和染色面積百分比綜合決定。其中，信號強度的評分標準為：無染色0分，弱染色1分，中染色2分，強染色3分。染色面積的評分標準為：無著色范圍0分，1%～20%為1分，21%～50%為2分，51%～100%為3分。最終的評分為兩者得分的乘積。兩者得分之積≥3分為高表達，＜3分為低表達。

1.5 數據分析

所 得 數 據 用Microsoft Excel、SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析。用Mann-Whitney

U

檢驗兩組數據的差異。采用Pearson卡方檢驗和Fisher精確檢驗分析SERPINE1 mRNA表達水平與臨床病理指標之間的相關性。采用Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank分析SERPINE1 mRNA陽性表達與患者預后的關系，進一步通過Cox比例風險模型分析不同臨床病理指標和SERPINE1 mRNA表達水平對患者術后生存時間的影響。采用雙側檢驗，以

α

=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 數據庫中SERPINE1 mRNA的表達水平變化

分析GEO數據庫中的GSE20347數據集，發現與癌旁正常組織相比，SERPINE1 mRNA在食管鱗癌中的表達顯著升高(

n

=17，

P

＜0.01，圖1A～圖1B)。進一步分析食管鱗癌的TCGA RNA測序數據，發現SERPINE1 mRNA表達水平與組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移等均無顯著相關關系(圖1C～圖1F)，但SERPINE1 mRNA表達水平較高的患者生存期較短，雖差異無統計學意義，但提示SERPINE1的表達可能與食管鱗癌預后相關(圖1G)。

圖1 SERPINE1 mRNA在數據庫樣本中的表達情況

2.2 食管鱗癌組織中SERPINE1 mRNA的表達水平與臨床病理指標的相關性

使用含有236例食管鱗癌組織和手術切緣形態學正常的食管癌旁上皮組織芯片，進行SERPINE1 mRNA表達水平的原位檢測，其在食管鱗癌組織中的陽性表達率為23.7%(56/236)，而在癌旁組織中完全測不到，兩者之間表達水平差異具有統計學意義(

P

＜0.01，圖2和表1)。食管鱗癌組織中SERPINE1 mRNA的表達與臨床病理指標的關系見表2，統計分析結果顯示，SERPINE1 mRNA表達水平與性別、腫瘤浸潤深度、腫瘤分級及病理分期相關(均為

P

＜0.05)。

表1 食管鱗癌及手術切緣正常上皮中SERPINE1 mRNA的表達情況

表2 食管鱗癌組織中SERPINE1 mRNA表達與臨床病理指標的關系

圖2 SERPINE1 mRNA原位雜交結果代表圖

2.3 SERPINE1 mRNA的表達水平與食管鱗癌患者預后的關系

Kaplan-Meier生存曲線顯示，SERPINE1 mRNA高表達患者的生存時間(21.25個月)顯著短于低表達(44.4個月)的患者(

P

=0.017，圖3)。單因素分析顯示，SERPINE1 mRNA水平、N分期和臨床分期與患者的生存時間相關(均

P

＜0.05)；包括SERPINE1 mRNA水平、N分期和臨床分期的多因素Cox回歸分析結果顯示，SERPINE1 mRNA的高表達是食管鱗癌患者不良預后的獨立影響因素(表3)。

圖3 SERPINE1 mRNA表達水平與食管鱗癌患者術后總生存率的關系

表3 食管鱗癌患者術后總生存時間的單因素和多因素回歸分析

3 討論

復發轉移是食管癌治療失敗及患者死亡的主要原因之一。有效的預后標志物可輔助臨床醫生將根治術后患者的預后風險分為高危組和低危組，從而對高危組患者進行及時的干預，并能防止對低危組的過度治療，實現腫瘤患者的精準化、個體化治療，以達到延長患者生存的目的，在改善患者預后及提高生存率方面具有重要的意義及應用價值。

SERPINE1

基因的編碼產物纖溶酶原激活物抑制因子1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator，uPA)的關鍵調節劑，屬于纖溶酶原激活系統的成員。PAI-1是一種分泌蛋白，有研究發現在黑色素瘤中，PAI-1的活性增強會增加轉移的風險；在乳腺癌患者，血漿PAI-1的水平升高是乳腺癌潛在的預后標志物。PAI-1在胃癌、卵巢癌、膠質瘤、腎透明細胞癌等組織中也存在表達異常，且與患者的不良預后相關。關于SERPINE1在食管鱗癌中的研究，Zhang等曾于2014年報道在食管鱗癌組織中PAI-1蛋白表達的陽性率高于正常食管組織，且其表達與腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移相關，但與預后無顯著相關。在食管鱗癌細胞中，敲降

SERPINE1

基因可顯著抑制食管鱗癌細胞的侵襲和遷移能力。本研究首次采用RNA原位雜交方法檢測了食管鱗癌組織中SERPINE1 mRNA的表達情況，結果顯示SERPINE1 mRNA的表達水平在23.7%的食管鱗癌病例中異常升高，其表達水平與食管鱗癌患者的總生存率顯著相關，且是獨立的不良預后因素，這與上述PAI-1表達與其他腫瘤的預后不良相關的報道是一致的，而與Zhang等對食管鱗癌的研究結論略有不同。不過，我們注意到在Zhang等研究的結果中PAI-1陽性的患者也有生存較差的傾向，雖然

P

值不具有統計學意義，但顯示臨界相關(

P=

0.055)。因此，我們推測PAI-1表達可能確是患者預后較差的重要因素。而且提示在診療過程中，SERPINE1 mRNA高表達的患者可能需要給予更積極的術后輔助治療。

綜上所述，本研究發現SERPINE1 mRNA在食管鱗癌中存在異常表達，其高表達與患者的不良預后相關，并且是獨立預后因素。SERPINE1 mRNA有可能作為食管鱗癌分子分型、輔助治療及預后評估的標志物。