帕金森病小鼠模型自主活動狀態下的運動啟動分析

王夢月 趙 鑫 曹 梟 王 可 賈 軍

(首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學學系，北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種復雜的神經退行性疾病，其臨床癥狀主要表現為運動遲緩、靜止性震顫、肌肉強直、姿勢異常等運動障礙[1-2]。臨床上對PD患者這些運動癥狀的評價，多采用帕金森病統一評分量表(Unified Parkinson’s Disease Rating Scale, UPDRS)[3]，而基礎研究中對PD動物模型多采用運動行為檢測，如曠場行為、轉棒實驗、爬桿實驗及步態分析等[4]。這些指標代表著運動速度和運動幅度的改變，雖能較好地反映PD患者或動物模型的運動能力及運動協調性的變化，但對運動啟動障礙的評價卻一直缺乏有效、靈敏的指標。

臨床研究[5-6]顯示，PD患者從站立姿勢到開始行走的時間顯著慢于正常人，提示PD患者存在運動啟動障礙；然而在PD患者的Hoehn-Yahr(H-Y)分級評分量表[7]中，對運動啟動障礙依然沒有明確的評價標準。在基礎研究的動物模型中，對運動啟動的研究可劃分為兩種方式，一種是采用有獎賞或刺激線索的操作式行為模式來評價運動啟動[8-10]，但這種模式會影響運動啟動評價的準確性；第二種則是在自由活動狀態模式下來評價運動啟動[11-13]，然而此類模式多集中于對運動啟動前或運動啟動后的運動改變研究，較少關注運動啟動期間的變化[11]。因此，設定客觀、標準的運動啟動指標，是認識PD運動啟動障礙產生機制的重要環節。本研究根據小鼠的運動啟動事件，定義出運動啟動潛伏期(latency)，比較了自主活動狀態下正常小鼠與PD模型小鼠的運動啟動差異，為揭示PD運動啟動障礙機制提供一種良好的測量指標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠，6～8周，體質量20～22 g，雌雄不限，由北京維通利華實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0008，飼養于首都醫科大學實驗動物部實驗室。實驗動物的使用遵循醫學實驗動物管理實施細則(1998年衛生部令第55號)以及首都醫科大學實驗動物管理細則。所有操作得到首都醫科大學倫理審查委員會的批準，倫理號：AEEI-2017-062。

1.2 主要藥品和試劑

6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA, 貨號H116-5 MG)、阿撲嗎啡(apomorphine, APO, 貨號Y0001465)和甘氨酸(貨號G8898-500G)，購于美國Sigma-Aldrich公司。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)抗體(兔源一抗, 貨號P40101)購于Pel. Freez公司，紅色熒光二抗[驢抗兔IgG (H+L), Alexa Fluor 546, 貨號A21206]購于美國Invitrogen公司。

1.3 主要儀器

行為學視頻記錄系統(Neuromotive系統，美國Blackrock公司)，Noldus動物行為分析系統(Ethovision XT15,荷蘭Noldus公司)。

激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8,德國Leica公司)

1.4 實驗方法

1.4.1 PD小鼠模型制備

1%(質量分數)戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，將小鼠固定在立體定位儀上，以前囟為原點定位小鼠內側前腦束(medial forebrain bundle, MFB),位點囟后1.2 mm, 右側旁開: 1.2 mm, 深度: 4.75 mm。將3 μg 6-OHDA微量注射于小鼠右側MFB，制備單側損傷PD小鼠模型。注射2周后，利用APO誘導的旋轉實驗進行模型篩選，以對側旋轉凈圈數≥5 r/min者判定為成功的PD模型小鼠[14]。

1.4.2 曠場行為學記錄

將小鼠放置于白色曠場箱(42 cm×28 cm×20 cm)。暗光條件下利用紅外攝像機在曠場正上方記錄小鼠的自由活動，采樣頻率為50 Hz，記錄20 min。隨后利用Noldus動物行為分析系統分析小鼠運動軌跡，計算小鼠實時運動速度。通過Python自編程序對運動速度進行分析，篩選運動啟動事件。

1.4.3 自主活動基礎上篩選出小鼠的運動啟動事件

通過Python自編程序對運動速度進行分析，篩選運動啟動事件。首先，界定出自主活動小鼠的靜止狀態和運動狀態[11, 15]：當小鼠的運動速度小于0.2 cm/s且至少持續2 s以上的時間認為其處于靜止狀態，當小鼠的運動速度大于2 cm/s且至少持續2 s被認定為其處于運動狀態；然后，當小鼠存在從靜止到運動的狀態轉換則認定為一個運動啟動事件。在這個過程中，設定即將開始運動啟動的時間點(即在靜止狀態下其運動速度即將超過0.2 cm/s的最后時間點)為運動啟動時刻點(motion initiation, MI)；將隨后界定為運動狀態下其運動速度達到2 cm/s的第一個時間點設為T1，最后將MI到T1的時程定義為運動啟動的潛伏期(latency)，這代表著小鼠從靜止狀態到運動執行狀態所需的時間。

1.4.4 免疫熒光染色

完成行為學實驗記錄后，戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠，經4%(質量分數)多聚甲醛心臟灌流后取腦，冰凍切片機進行冠狀切片，厚度為40 μm。對中腦黑質和紋狀體腦片進行TH的免疫熒光染色。腦片在TH抗體(1∶1 000)中4 ℃孵育48 h，驢抗兔熒光第二抗體(546 nm, 1∶500)避光4 ℃孵育過夜。貼片及封片后采用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 PD小鼠模型的建立及檢測

按照實驗流程(圖1A)，在小鼠右側MFB注射6-OHDA建立單側損傷PD小鼠模型(model)。造模14 d后，以APO誘導凈旋轉圈數≥ 5轉/min者為PD小鼠模型，相同位點注射等體積0.9%(質量分數)氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)作為對照組小鼠(sham)。TH免疫熒光染色結果顯示，PD小鼠模型損傷側黑質致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺(dopamine, DA)能神經元數目及紋狀體(striatum, Str)內DA投射纖維均出現了明顯丟失(圖1B)，表明6-OHDA單側損傷模型建立成功。采用曠場實驗檢測小鼠的運動速度，結果表明PD模型組小鼠平均運動速度明顯低于正常組小鼠[sham：(6.13 ±0.42) cm/s，n=20；model：(4.58±0.41) cm/s，n=19]，差異有統計學意義(t=2.65，P=0.01)，詳見圖1C；提示PD小鼠存在著運動障礙。

圖1 帕金森病小鼠模型的建立Fig.1 Establishment of Parkinsonian mouse modelsA: timeline for the 6-OHDA injection and behavioral tests; B: confocal photomicrograph examples of coronal brain sections from a 6-OHDA unilaterally lesioned parkinsonian mouse [The white dashed lines indicate the STR (top) and SNc (bottom). The tyrosine hydroxylase (red) shows unilateral loss of dopamine neuron terminals (top) and bodies (bottom)]; C: average velocity of the sham group and the model group; *P<0.05; sham n=20 mice, model n=19 mice; STR: striatum; SNc: substantia nigra pars compacta; 6-OHDA: 6-hydroxydopamine.

2.2 PD小鼠模型運動啟動潛伏期

基于運動啟動事件的定義，利用Python程序對小鼠運動速度進行數據處理，篩選出正常組小鼠和PD模型組小鼠的運動啟動事件，并比較其運動啟動的潛伏期。結果顯示小鼠運動啟動的潛伏期呈偏態離散分布(圖2A、B)。PD模型組小鼠運動啟動的潛伏期中位數為0.46(1.1)s，對照組為0.90(0.77)s。經非參數檢驗，兩組之間差異無統計學意義(U=311.50，P=0.10)，詳見圖2C。

圖2 運動啟動事件的定義以及運動啟動潛伏期區間的劃分Fig.2 Definition of the motion initiation events and the division of the latencyA: a sample of the motion initiation event(The figure shows the velocity related to MI. The grey shadow indicates the range of the latency.); B: histogram for the motion initiation events frequency and its distribution curve of the sham and the model group; C: latency for the sham and the model group(The black dots show the latencies of individual motion initiation events.); D: proportion of the latency for the sham and the model group in each latency interval; sham n=23 mice, model n=22 mice； MI: motion initiation.

因此，按照0.5 s的bin值進行劃分，并統計了全部潛伏期區間內運動啟動事件占所有事件的比例(圖2D)。結果顯示，在PD模型組小鼠中，潛伏期 ≤ 0.5 s的運動啟動事件占到了51.61%，高于對照小鼠在此區間內的運動啟動事件(18.52%)；而對照組小鼠的運動啟動事件多集中在潛伏期 > 0.5 s的范圍內(圖2D)。因此，結果提示對照組與PD模型組小鼠運動啟動潛伏期數據存在著不同的時域分布范圍。

2.3 潛伏期對PD模型小鼠運動啟動時間的影響

分別對潛伏期≤0.5 s和>0.5 s時限范圍內的運動啟動事件進行分析，結果顯示，潛伏期≤0.5 s時,PD模型小鼠的運動啟動較正常對照組小鼠的運動啟動潛伏期明顯縮短[sham:(0.38±0.04) s，n=23; model：(0.27±0.02) s,n=22]，差異有統計學意義(t=2.27，P=0.03)，詳見圖3A、B。而潛伏期>0.5 s時，PD模型組小鼠運動啟動潛伏期較對照組組小鼠明顯延長[sham：(1.16±0.11) s,n=23; model：(1.73±0.23) s,n=22]差異有統計學意義(t=2.07，P<0.05)，詳見圖3C、D。

圖3 兩類運動啟動事件的運動啟動潛伏期Fig.3 The latency for the two types of the motion initiation eventsA: a sample of the motion initiation event when the latency≤0.5 s (The shadow indicates the range of the latency ≤0.5 s.); B: latency for the sham and the model group when the latency ≤0.5 s; C: a sample of the motion initiation event when the latency >0.5 s(The shadow indicates the range of the latency>0.5 s.); D: latency for the sham and the model group when the latency >0.5 s; The black dots show the latencies for the individual motion initiation events; *P<0.05, sham n=23 mice, model n=22 mice.

3 討論

本研究依據小鼠從靜止到運動狀態的轉換來篩選出運動啟動事件，并首次引入了運動啟動潛伏期這個新指標，從運動速度和啟動時間的二維指標來動態描述小鼠的運動啟動過程，客觀準確地評價了運動啟動的快慢；并基于這樣的指標，對PD小鼠模型的運動啟動障礙進行了深入分析。結果表明PD模型組小鼠的運動啟動潛伏期數據呈現偏態分布，繼而劃分為潛伏期≤0.5 s和潛伏期>0.5 s兩個時限范圍進行分析，首次揭示出PD模型小鼠存在著快速多次的運動啟動和相對遲緩的運動啟動，這為揭示PD的運動啟動障礙提供了新的研究思路。

結果顯示，在潛伏期≤0.5 s的運動啟動時限范圍，PD小鼠模型出現了比正常小鼠更快的快速啟動。這似乎與PD狀態應該是具有較慢的運動啟動現象存在著矛盾之處。筆者推測，PD小鼠的這種多次的快速運動啟動事件，可能涉及到PD小鼠對準備行為的控制時間不足，進而導致后續運動執行的錯誤。研究[16]表明人類和動物的行為，始終存在著速度與準確性之間的平衡，需要借助運動控制(motor control)才能全面描述運動。當動作執行的速度越快時，動作的準確性就會降低；這一特點對運動啟動來說也同樣如此。當PD模型組小鼠出現運動啟動過快，這可能就會導致其啟動階段的運動準備控制時間不足，使得后續運動不能有效執行。Howe等[17]和Gritton等[18]新的研究提出膽堿能中間神經元(cholinergic interneurons, CHIs)活動反映的是運動狀態的快速轉變，而DA的活動則提供產生和維持這種運動狀態所需的快速驅動力[19]。在正常運動情況下，DA與CHIs存在著動態的平衡；但在PD中DA減少時，CHIs的活動占主導地位會加劇運動狀態的快速轉變，導致出現過多過快的運動啟動；但由于DA丟失，則會導致這種快速運動啟動喪失了繼續維持的動力，以及對隨后的運動執行也喪失了維持動力。因此，PD小鼠的這種快速啟動雖然可以產生，但難以維系并真正達到運動啟動以及其后的運動執行，此特點提示快速運動啟動對PD運動障礙的效應和機制值得進一步深入關注。

對于潛伏期>0.5 s時限范圍的運動啟動事件來說，PD模型小鼠產生了明顯的運動啟動潛伏期延長，由于DA活動具有的促進運動準備的作用[19]以及維持啟動后的運動執行的作用[18-19]；當DA減少時，直接導致運動啟動需要準備更長的時間，以及后續運動速度和運動執行能力均下降。此外，根據經典的基底神經節頻率模型，激活直接途徑促進運動，而激活間接途徑抑制運動[20]。DA減少導致了兩條通路神經元活動不平衡，出現間接通路活動的增加[21]，因此PD模型小鼠可能由于間接通路的過度激活，使得運動啟動的潛伏期增長。另外，DA丟失會導致PD動物模型產生一種代償性的反應，需要犧牲運動速度以保證運動的準確性[16, 22]，導致出現運動速度減慢的特征。在本研究中,PD模型組小鼠不僅在潛伏期>0.5 s時限范圍的運動啟動事件中存在運動啟動遲緩，而且也出現了運動速度降低的結果，符合PD狀態下經典的運動啟動遲緩現象。

因此本研究首次對小鼠自主活動過程中的運動啟動過程進行了新的界定，發現PD模型小鼠存在著不同類型的運動啟動障礙，不僅有助于更加全面了解PD運動障礙，更為運動啟動的神經機制研究提供可參考的行為學模式。