基于網絡藥理學探討三七治療骨關節炎的有效活性成分及潛在作用機制

賴燕清

（福建醫科大學附屬龍巖第一醫院 龍巖364000）

骨性關節炎（Osteoarthritiis,OA）是臨床中最常見的一種骨退行性病變，臨床多表現為關節疼痛、腫脹以及活動受限[1～3]。流行病學研究結果顯示，全球范圍內約有1.4億人患有OA[4]。目前OA治療并無靶向性藥物，早中期多使用非甾體類藥物干預，但存在明顯的胃腸道副反應，因此只適合短期對癥治療[5～6]。中醫藥對于早中期OA有著良好的療效，在OA的治療中日益受到認可[7]。三七是一味臨床上常見治療OA的中藥，具有祛風除濕、通痹止痛的功效[8～9]。現代藥理學研究顯示，三七具有抗炎、鎮痛以及抗腫瘤等作用[10～11]。但三七對OA的作用機制，目前尚不明確。網絡藥理學可以利用現有文獻基礎和生物信息學，從多成分、多靶點以及多通路的角度出發，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，探討多種中藥成分與疾病之間的相互作用機制。因此本研究擬運用網絡藥理學技術，初步探討三七配伍對OA的作用機制，以期為后續研究提供理論參考。現報道如下：

1 工具與方法

1.1 三七活血成分及潛在治療靶點收集 使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）數據庫[12]對三七的活性成分進行篩選。以利用度（OB）≥30%以及類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，并將篩選后的活性成分使用TCMSP、草藥成分指標數據庫（Herbal Ingredients'Targets Database,HIT）[13]及PubChem數據庫查找相應靶點，并使用Excel進行整理。

1.2 OA治療靶點收集 使用治療靶點數據庫（Therapeutic Target Database,TTD）[14]以 及GeneCards數據庫[15]收集OA潛在治療靶點，以“Osteoarthritis”為檢索詞，采用Excel將得到的靶點信息進行整合。TTD數據庫即含有研究成功的臨床藥物靶點，也有目前在研的藥物靶點，且均經過試驗驗證，可信度較強。GeneCards通過整合網絡多個基因數據庫，含有所有關于人類的基因注釋信息和預測信息，信息較全。

1.3 構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡 將三七有效活性成分相應靶點以及OA治療靶點進行合并，取其交集，即為三七-OA潛在治療靶點。以三七有效成分和三七-OA潛在治療靶點為節點，在Excel表格中建立藥物-成分-靶點-疾病關系，導入Cytoscape3.7.2軟件中建立三七活性成分與OA治療靶點之間的相互作用網絡。

1.4 KEGG通路以及GO富集分析 將三七-OA潛在治療靶點在David網站[16]進行KEGG（京都基因與基因組百科全書）通路富集分析以及基因本體（Gene Ontology,GO）生物過程富集分析，GO分析包括生物學過程（Biological Process,BP）、細胞組分（Cellular Component,CC）、分子功能（Molecular Function,MF）三個部分。使用R語言對P值進行校正并選擇前10個分析結果進行氣泡圖展示，進一步探討三七治療OA的潛在作用機制。

1.5 關鍵基因鑒定以及子模塊分析 使用STRING數據庫[17]對三七-OA治療靶點構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI），隨后使用Cytoscape軟件進行可視化。具有最高自由度的基因被認為是關鍵基因。對三七-OA共靶向基因進行模塊分析，使用MCODE插件進行子模塊分析，子模塊納入標準如下：MCODE評分＞5，節點數量＞10，并對模塊分析結果進行KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 三七活血成分及潛在治療靶點 在TCMSP數據庫中，以口服OB≥30%以及DL≥0.18為篩選條件，檢索到8種三七有效成分，其中包括β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素以及人參皂苷等。見表1。將檢索到的有效成分在TCMSP及HIT數據庫上收集相應的治療靶點，Excel整理查重后共有186個治療靶點。

表1 TCMSP數據庫中三七有效成分

2.2 三七治療骨關節炎靶點 通過檢索TTD以及GeneCards數據庫，Excel整理取出重復值，共篩選出骨關節炎潛在治療靶點1 282個。將三七治療靶點與骨關節炎治療靶點進行匹對，共發現靶點88個。見圖1。

圖1 三七治療OA靶點

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡 將三七的每個有效成分和其相對應治療靶標導入Cytoscape軟件中，繪制成分-靶點對應圖形，以紅色倒三角形代表三七活性成分，黃色圓形代表潛在治療靶點。結果顯示三七中主要活性成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、人參皂苷Rh2、食脂素、亞油酸乙酯以及槲皮素，而其中最主要的三個活性成分為β-谷甾醇、人參皂苷Rh2以及槲皮素。見圖2。

圖2 “三七-成分-靶點-疾病”網絡圖

2.4 KEGG通路富集分析 將關鍵靶基因在David網站中進行KEGG通路富集，共富集顯著性通路101條。使用R語言對P值進行校正并選擇前10條通路進行氣泡圖展示。結果顯示三七治療OA的信號通路主要富集在腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、Toll樣受體信號通路、凋亡以及缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路等。見圖3。

圖3 三七-OA共同靶點KEGG通路富集分析結果

2.5 GO富集分析 將獲得的三七-OA共同靶點放入David網站上進行GO富集分析，選擇生物學過程（BP）、分子功能（MF）以及細胞組分（CC）三個內容。結果顯示三七-OA共同靶點在BP上主要富集在藥物反應、衰老、缺氧反應以及炎癥反應等生物學過程上；在MF上主要富集在酶結合、轉錄因子結合、蛋白結合以及細胞因子活性等分子功能上；在CC上主要位于細胞外間隙、胞膜以及細胞質中。見圖4～圖6。

圖4 三七-OA共同靶點GO-BP富集分析結果

圖5 三七-OA共同靶點GO-MF富集分析結果

圖6 三七-OA共同靶點GO-CC富集分析結果

2.6 關鍵基因以及子模塊分析 三七-OA共同靶點蛋白-蛋白互作網絡如圖7所示，自由度前3個基因分別為IL-6、TNF以及AKT1，被認為是關鍵基因。MCODE插件發現子模塊1個，含有45個節點、780條邊，如圖8A所示。使用David數據庫對子模塊進行KEGG分析，子模塊基因主要富集在TNF信號通路以及類風濕性關節炎等。見圖8B。

圖7 三七-OA共同靶點蛋白-蛋白互作網絡

圖8 子模塊分析以及KEGG通路富集分析結果

3 討論

隨著我國老齡化社會程度加重，我國OA患者呈逐年增加趨勢。OA的主要病理表現有滑膜炎癥、軟骨損傷以及軟骨下骨的反應性增生[18]。流行病學調查結果顯示，OA是導致下肢殘疾的十大原因之一[19]。關節置換術被認為是治療終末期OA的黃金方法，但其仍然存在療效不滿意、并發癥高、感染、返修等不足[20]。因此如何延緩早中期OA患者過早進展成重度OA，延緩初次關節置換年齡一直是骨科醫師研究的重點。

中醫藥在早中期OA治療中的療效一直受到認可[7,21]。OA屬于中醫學痹病范疇，多由于素體正氣不足，腠理不密，衛外不固，外邪入侵可使津血運行不暢，氣滯血瘀，不通則痛；此外長期反復發作可進一步損傷肝腎，導致肝腎虧虛，筋脈失養，不榮則痛。三七有化瘀止血、活血定痛功效，對于早中期OA患者，可以有效促進血液運行，避免氣滯血瘀，延緩早中期OA患者過早進展成重度OA。戶紅卿等[9]的研究結果顯示，三七結合針灸可以有效改善血瘀型膝原發性骨關節炎患者臨床癥狀；喬登朝等[22]的研究結果也顯示三七可以有效抑制創傷性膝關節滑膜炎，抑制患者疼痛。現代藥理學研究結果也顯示三七總皂苷可以有效抑制關節炎大鼠血清中炎癥介質的表達，從而達到抑制滑膜炎、改善患肢功能的療效[10]。此外，三七總皂苷聯合白芍總苷具有抑制急性痛風性關節炎大鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α含量，并抑制滑膜組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α等表達的作用[23]，然而三七對于OA的作用機制，目前尚不明確。

本研究從網絡藥理學出發，探討三七治療OA的潛在治療機制。本研究共檢索出三七8種有效治療成分，映射治療OA靶標88個。在“藥物-成分-靶點-疾病”網絡中發現有3種有效成分最為顯著，即β-谷甾醇、人參皂苷Rh2以及槲皮素。GO富集結果顯示三七-OA共同靶點主要富集在藥物反應、衰老、缺氧反應以及炎癥反應等生物學過程上，提示三七可以有效抑制OA炎癥，這與之前的文獻結果也是相符的[10，23]。KEGG通路富集結果顯示三七治療OA的信號通路主要富集在TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、凋亡以及HIF-1信號通路等。TNF信號通路、Toll樣受體信號通路與炎癥、免疫調節等生物學功能密切相關，進一步提示三七對于OA炎癥的抑制作用。此外，PPI網絡顯示三七治療OA的前3個關鍵基因為IL-6、TNF以及AKT1，且子模塊KEGG通路富集分析結果也顯示主要富集在TNF信號通路上，提示三七治療OA可能與TNF炎癥信號通路相關。

綜上所述，本研究以經典中藥三七為研究對象，利用網絡藥理學和生物信息學相關技術，探討三七治療OA的有效活性成分、潛在靶點以及相關信號通路，構建藥物成分靶點網絡并進行KEGG和GO富集分析，闡述三七治療OA的潛在作用機制。結果顯示三七治療OA最主要的三個活性成分為β-谷甾醇、人參皂苷Rh2以及槲皮素；三七治療OA主要涉及炎癥反應、衰老、缺氧等生物學過程；三七治療OA主要通過腫瘤壞死因子信號通路、衰老以及Toll樣受體相關通路等；三七治療OA前3位關鍵基因為IL-6、TNF、AKT1。