蕓苔素內酯·吲哚乙酸·赤霉酸在不同氮濃度下對小白菜產量和品質的影響

王慶彬，彭春娥，孟慧，王洪鳳，王曉琪，賈春花，李澤麗，李洋，耿全政，劉之廣*，張民*

（1.土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東農業大學資源與環境學院，山東 泰安 271018；2.山東蓬勃生物科技有限公司，山東 泰安 271018；3.作物生物學國家重點實驗室，山東農業大學生命科學學院，山東 泰安 271018）

我國是世界上最大的蔬菜生產國和消費國，國家統計局數據顯示，2017 年我國蔬菜播種面積為1 953.33 萬hm2，總產量約為7.89 億t。白菜起源于中國，是我國栽培面積和生產供應數量最大的蔬菜作物，在我國周年生產、供應和穩定蔬菜市場等方面發揮重要作用，作為葉菜，其生產過程中需要投入大量的氮肥[1]。在小白菜生產中氮素發揮關鍵作用，適當提高供氮濃度可提高小白菜產量[2]和可溶性蛋白的含量，但是供氮濃度過高則會造成小白菜減產，品質下降[3-6]，抗病性減弱，同時還會造成土壤酸化和板結、水體富營養化、溫室效應等一系列環境問題[7]。提高氮肥利用率，進而提升作物產量和品質，是我國蔬菜產業健康發展過程中亟需解決的問題。

碧護（BHG）是復合型的植物源生長免疫誘導劑，主要成分為0.136%的蕓苔素內酯·吲哚乙酸·赤霉酸，含有黃酮類催化平衡成分、氨基酸化合物、抗逆誘導劑等多種植物活性物質[8]。在提高作物氮肥利用率方面具有顯著效果，可提高水稻、蘋果、小麥、花生等作物產量和品質[9-14]。蕓苔素內酯（BR）可通過與受體BAK1 的結合激活BR 信號轉導路徑中BSK3 激酶，調節作物根系生長[15]；可通過BZR1信號激發作物體內自噬相關基因（ATGs）的轉錄和自噬體的形成，增強葉綠素含量，減少泛素化蛋白的積累，進而提高植物獲取氮營養能力[16]。外源BR 顯著影響作物內源激素吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）相關基因MdBAK1、MdBRI1、MdBZR1等的表達和轉錄，顯著提高關鍵生長素合成和轉運基因，促進根和莖內生長素含量，降低ABA 和GA3含量，影響側根發育[17-20]。Zhang 等[21]研究指出外源IAA、GA 對玉米的內源激素合成路徑同樣有顯著影響。Haruta 等[22]報道指出激素途徑的變化顯著影響植物體內有機酸的分泌。而有機酸一方面顯著影響作物的外觀品質和食味品質[23]，另一方面通過改善植物生長環境，促進植物對礦質養分的吸收利用，提高植物對養分的利用效率，且能在用肥量過大時緩解肥害[24]。

激素信號反饋控制氮素調控、代謝的分子網絡路徑，而激素的合成、耦合、降解、轉運和信號轉導又受外源氮素的調控，這是由于氮素除了作為營養物質外，還作為植物生長發育調控通路的重要觸發因子與激素路徑交叉互作[25]。但是氮素用量和BHG 耦合對蔬菜作物產量、品質的影響及作用機理研究鮮有報道，本研究以水培為培養條件，小白菜為研究對象，探討其產量、品質與不同外源氮水平條件下BHG 的響應關系，為實現氮肥的減肥增效和小白菜的高產高質提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和培養方法

試驗于2019年5月2日—2019年6月3日在山東農業大學土肥資源高效利用國家工程實驗室人工智能光照培養箱（GXZ，寧波江南）中進行培養。供試小白菜（Brassica chinensisL.）品種“速生綠秀”。BHG 由上海拜諾國際生物科技進出口公司提供。

小白菜培養：小白菜種子在純凈水中浸泡12 h，70%乙醇滅菌1 min，在無菌蒸餾水中洗滌3 次。2%的次氯酸鈉浸泡5 min，在無菌蒸餾水中漂洗5 次，播種于128格海綿塊育苗盤。參數設置如下：日/夜溫度25 ℃/20 ℃，光強380 μmol·m?2·s?1，由日光燈提供，光照周期為12 h，日/夜濕度60%/40%。小白菜幼苗在兩葉一心期移栽到水培培養箱中，水培營養液內含有2 mmol·L-1KH2PO4，4 mmol·L-1CaCl2，1.4 mmol·L-1MgSO4·7H2O，2 mmol·L-1K2SO4，0.4 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.1 μmol·L-1NaMoO4·2H2O，8 μmol·L-1H3BO3，10 μmol·L-1MnCl2，1 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，18.3 μmol·L-1FeSO4·7H2O，5 μmol·L-1Na2EDTA，pH 調整為6.2。氮源為甘氨酸和硝酸銨混合液（摩爾比為1∶1），根據設計的氮水平添加相應氮源劑量[26]。通氣泵無間隔通氣，第10 d和第20 d分別調節pH為6.2，處理時間為30 d。

1.2 試驗設計

培養液設計1、3、10 mmol·L-13個氮濃度，在每個氮濃度培養液中分別添加去離子水和BHG（5 μg·L-1），共6個處理（表1），6次重復。

表1 試驗處理Table 1 Treatments for experiment

1.3 測定項目和方法

1.3.1 小白菜長勢指標

小白菜移栽30 d 后，統計葉片數量，地上部及根鮮質量、長度分別由電子天平和直尺測得，計算根冠比；鮮樣在烘箱內105 ℃殺青30 min，85 ℃烘干至恒質量，稱量干質量。

1.3.2 葉片可溶性蛋白和可溶性糖

小白菜收獲后，硫酸-蒽酮比色法測定可溶性糖含量，考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量[27]。

1.3.3 小白菜氮磷鉀含量

干樣磨碎過0.25 mm 篩，稱取0.20 g，H2O2-H2SO4消煮，測定氮、磷、鉀含量，氮含量根據凱氏定氮法測定，磷含量根據鉬銻抗比色法測定，鉀含量根據火焰光度計法[28]測定。

1.3.4 有機酸

高效液相色譜法檢測葉片、根部及營養液中草酸的含量。液氮研磨處理后，稱取0.20 g 樣品，4 mL 超純水懸起，超聲15 min，4 ℃下15 000g離心20 min；用0.22 μm 濾膜抽濾上清液用于上樣。流動相A：10 mmol·L-1磷酸氫二銨，pH 2.45（用磷酸調節），流動相B：甲醇，分析柱：Inertsil ODS-3（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm。流速0.4 mL·min-1，洗脫程序如下：0～5 min，甲醇比例由3%線性增加至8%；5～15 min，甲醇比例由8%線性降至3%。有機酸標準品購自美國Sigma公司。

1.3.5 葉片激素

高效液相色譜法測定內源激素的含量，稱取0.20 g 葉片，加入2 mL pH 7.2 的磷酸緩沖鹽（Phos?phate buffer saline，PBS，pH7.2）溶液，冰浴研磨，4 ℃下15 000g離心10 min，取上清。流動相為甲醇∶乙腈∶0.6%乙酸=50∶45∶5（V/V），分析柱為Symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃，流動相流速0.6 mL·min-1，檢測波長為264 nm。GA、IAA、ABA、玉米素（ZT）、水楊酸（SA）標準品均購自美國Sigma 公司[29]。

1.4 數據處理

采用Excel 2007 軟件對數據進行整理，采用SAS V8 數據處理系統進行方差分析，采用Duncan 新復極差法進行差異顯著性檢驗（α=0.05）。采用Origin 8.0繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同氮濃度下BHG對小白菜產量及品質的影響

2.1.1 氮水平和BHG互作對小白菜產量的影響

氮濃度對小白菜產量和干質量均影響顯著（表2），不添加BHG 處理隨著氮濃度的升高，小白菜產量和干質量呈現增加趨勢。CKN1 比CKN3 處理減產33.86%。CKN10比CKN3增產13.65%。BHGN3較CKN3 增產14.87%，與CKN10 產量相當；BHGN1 與CKN1產量無顯著差異，BHGN10 較CKN10減產7.69%，但差異不顯著。BHGN3 較CKN3 總干質量增加5.32%，BHGN1和BHGN10較相同氮水平清水處理總干質量顯著降低9.02%和16.91%。

2.1.2 氮水平和BHG互作對小白菜品質的影響

由圖1 可知，隨著氮濃度的提高，CK 處理葉片中可溶性糖含量逐漸降低，有機酸含量逐漸升高，糖酸比逐漸降低，可溶性蛋白先降低后升高。BHG 處理可溶性糖先降低后升高，有機酸含量逐漸升高，糖酸比先降低后保持穩定，可溶性蛋白先升高后降低，與CK 處理的變化趨勢不同。BHGN3較CKN3小白菜中可溶性糖的含量顯著降低0.26個百分點，有機酸含量顯著提高91.28%，糖酸比降低75.46%，可溶性蛋白含量顯著升高0.05個百分點；BHGN1較CKN1有機酸和可溶性蛋白分別顯著降低85.14%和0.04 個百分點，糖酸比顯著升高637.86%；BHGN10 較CKN10 小白菜中可溶性糖、有機酸含量分別顯著升高0.09個百分點和12.97%，可溶性蛋白顯著降低0.07個百分點。

對小白菜根部和營養液中有機酸檢測結果如圖2 所示，小白菜根部和培養液內有機酸的含量隨著氮濃度升高均明顯升高，水培條件下，成熟小白菜內有機酸主要為草酸，而酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸含量極少，未檢出（圖2C）。BHGN3 較CKN3 根部和營養液內的有機酸顯著提高23.89%、149.18%，BHGN10 較CKN10 根部和營養液內的有機酸顯著升高36.18%、16.21%。

圖2 不同處理小白菜根系及營養液內有機酸的含量Figure 2 Organic acids content in pakchoi root and nutrient solution with different treatments

由圖3 可知，隨著氮濃度的提升，小白菜葉內生長相關激素IAA、GA、ABA、ZT 含量均表現為先升高后降低，而抗病相關激素SA 含量呈現逐漸降低的趨勢。BHGN3 處理較CKN3 處理的IAA、ABA、GA、SA顯著降低12.55%、44.96%、66.13%、50.65%，ZT 含量顯著升高8.79%；BHGN1 處理較CKN1 處理中IAA 和SA 的含量顯著下降17.50%、89.45%，GA、ABA、ZT 含量顯著升高204.85%、98.11%、68.02%；BHGN10 處理較CKN10處理中IAA、ZT、SA的含量顯著升高17.74%、11.62%、23.57%，ABA、GA 的含量顯著降低19.40%、38.87%。BHGN1、BHGN3、BHGN10 處理的IAA/ABA 分別為等氮條件下對照處理的41.67%、158.88%、146.08%，ZT/ABA 比值分別為等氮條件下對照處理的84.81%、197.66%、138.50%。

圖3 不同處理小白菜激素的含量Figure 3 Hormone content in pakchoi with different treatments

2.2 氮水平和BHG互作對小白菜表型的影響

CKN3 處理較CKN1 處理小白菜株高顯著增高（表3），CKN10 處理與CKN3 處理間，株高無顯著差異；隨著氮濃度提高，小白菜根冠比顯著減小，根長顯著變短。BHGN3處理較CKN3處理根鮮質量、根干質量顯著增加22.95%、25.00%；BHGN1 處理較CKN1 處理的根長、根鮮質量、根干質量顯著下降12.50%、15.16%、21.21%；BHGN10 處理較CKN10 處理葉片數量顯著增加9.80%，根長顯著增加20.84%。

表3 不同處理下小白菜表型指標Table 3 Phenotypic characteristics of pakchoi with different treatments

2.3 氮水平和BHG 互作對小白菜養分吸收和利用的影響

隨著氮濃度的升高，CK 處理小白菜葉片和根部中氮、磷、鉀總含量先升高后保持穩定，添加BHG 后葉片中氮、磷、鉀總含量先升高后下降，根部變化趨勢與CK 處理一致（圖4A、圖4B）；BHG 的添加顯著促進了3 mmol·L-1氮水平下小白菜氮、磷、鉀總量的積累，顯著降低了10 mmol·L-1氮水平下氮、磷、鉀總量的積累。小白菜中氮的含量隨著供氮水平的升高顯著升高（圖4C），各處理磷的含量無顯著差異（圖4D），鉀的含量隨著供氮水平的升高先升高后降低（圖4E）；添加BHG的處理中，在3 mmol·L-1氮水平時小白菜鉀的含量顯著提高了2.64個百分點，但氮的含量顯著降低0.37 個百分點，在1 mmol·L-1和10 mmol·L-1氮水平下小白菜鉀的含量分別顯著降低了0.36、0.70個百分點。

圖4 不同處理小白菜氮磷鉀的含量Figure 4 NPK contents in pakchoi with different treatments

3 討論

BHG 的主要成分為0.136%的蕓苔素內酯·吲哚乙酸·赤霉酸，這些外源激素的添加顯著影響小白菜內源激素的含量。而植物內源激素是植物體內可自身合成的微量有機物，可通過與其他激素的互作在非常低的濃度條件下調控植物生長發育[30]。植物內源激素同樣受外源氮素含量波動的影響[31]。在低氮環境下植物通過NRT1.1轉運出側根內IAA 來抑制側根的伸長，促進主根的發育[32]；高氮條件下，植物體內氮素的積累提高了β-糖苷酶1的表達量，降解了儲存在根分生區內ABA-糖苷酯，釋放出ABA，進而抑制根系的伸長和發育[33]；高氮水平下作物還會降低高親和力蛋白基因NRT1.1、NRT1.2等表達，減少氮源的攝入，同時通過ZT信號反饋途徑抑制根系吸收氮，如抑制根系攝取硝酸鹽和木質部轉運的AtNRs基因表達，上調地上部氮吸收、轉運AtNRTs基因表達，增強硝酸鹽在莖葉中的分配和轉運[34]。植物內其他激素，如GA，可與氮相互協調來調控作物開花周期[35]。本研究中，BHG 在與3 mmol·L-1氮耦合互作下，顯著影響了激素間的平衡關系，而這些平衡關系顯著影響作物的生長，如ZT/ABA 值的改變會影響植物的生長勢[36]，IAA/ABA 值的改變會影響作物根體積、根質量[37]。因此，BHGN3的IAA/ABA和ZT/ABA值分別為等氮條件下對照的158.88%和197.66%時，根鮮質量、根干質量顯著增加22.95%、25.00%。鄒曉霞等[37]發現IAA/ABA、ZR/ABA 與作物根系干質量、總長度、體積和表面積呈顯著或極顯著正相關，這與本研究的結果相一致。說明BHG 的添加在適宜氮水平下有利于小白菜根系的生長，改變了作物表型。可能原因是BHG 對IPS1、PHT1、1 LPR1b、KRPs、EXPB1-4等根系發育相關基因的表達產生顯著影響，進一步影響根部軸向根伸長、側根密度和長度，調控作物根系形態。

BHG 改變的激素途徑對植物內有機酸的分泌影響顯著[22]，而根系分泌的有機酸具有改善作物品質、增強抗逆性、提高肥料利用率等生物功能[38-41]。戢林等[39]、常二華等[41]研究表明水稻根系分泌的草酸、檸檬酸對稻米食味品質有明顯影響。本研究中，BHGN3 處理較CKN3 處理根部和營養液內的有機酸顯著提高23.89%、149.18%，顯著改變了小白菜品質，小白菜中有機酸含量顯著提高91.28%，糖酸比降低75.46%，可溶性蛋白含量顯著升高0.05 個百分點。這與賈春花等[8]研究BHG 對櫻桃蘿卜產量和品質影響得出的BHG 降低櫻桃蘿卜品質的結論不同，這可能是因為栽培方式和肥料施用水平有差異。陳露等[42]研究表明紫色小白菜內有機酸主要為蘋果酸、檸檬酸、丙二酸、琥珀酸和酒石酸，而本試驗條件下，供試小白菜分泌積累的有機酸主要是草酸，與其存在差異，可能是由于小白菜品種不同。

BHG 同樣可調控激素路徑，進而影響作物對營養的吸收利用，如基質培養BR 可通過BZR1 信號激發作物體內自噬體的形成，增強葉綠素含量而減少泛素化蛋白的積累，進而提高植物獲取氮營養能力[16]。IAA 可提高大田正常供鉀植株的根系Vmax值（根系鉀吸收動力學參數）和內流型鉀離子通道基因NKT2、NtKC1的表達量，顯著增加地上部和地下部干質量6.05%、8.54%[43]。Zhang 等[21]研究指出外源IAA、GA通過影響IPS1、PHT1、1 LPR1b、KRPs、EXPB1-4等根系發育相關基因的表達，調控玉米根系形態，提高大田玉米對磷的吸收和積累。本研究中BHG 的添加，在3 mmol·L-1氮水平時小白菜內鉀的含量顯著提高了2.64 個百分點，但氮的含量顯著降低0.37 個百分點。可能原因是不同培養環境下，不同作物的氮、磷養分吸收狀況對BHG 的響應存在差異，而BHG 使植物體內有機酸含量提高，顯著促進作物對鉀素的吸收利用。BHG 可提高水稻、蘋果、小麥、花生等作物產量[9-14]，本研究發現BHGN3較CKN3顯著增產14.87%，干質量增加5.32%；BHGN1 較CKN1 增產不顯著，干質量顯著降低9.02%。可能原因是1 mmol·L-1氮水平下，氮素成為限制小白菜產量的主要因子，BHG 內激素過分刺激小白菜引起了小白菜的早衰。10 mmol·L-1高氮條件下，添加BHG 的處理中，小白菜ZT/ABA、IAA/ABA 值 比CKN10 升 高38.50% 和46.08%，根長顯著增加20.84%，根系有機酸、體內SA含量顯著提高36.18%、23.57%，但產量無顯著差異。可能的原因是作物在不同氮水平下啟動的氮吸收、轉運蛋白的分子網絡和激素調控途徑不同[44]，高氮水平下BHG 激發SA 路徑，提高作物抗脅迫能力需要消耗更多營養和能量[22，31]。綜上說明作物對BHG 的響應與施氮水平密切相關。

4 結論

（1）BHG 對小白菜產量、品質的影響與施氮水平密切相關，主要機理為調控小白菜內源激素含量。

（2）與對照相比，BHG 在3 mmol·L-1氮水平顯著增產，小白菜ZT/ABA、IAA/ABA 值提高97.66%、58.88%，根鮮質量、根干質量提高22.95%、25.00%，根部有機酸含量增加23.89%，植株有機酸含量91.28%，鉀含量增加2.64 個百分點，最終產量提高14.87%；BHG 在1、10 mmol·L-1氮水平下對小白菜產量無顯著影響。

因此，針對養分狀況合理施用BHG 是小白菜優質高產的有效手段。