藏藥普爾那提取物對宮頸癌海拉細胞增殖作用的研究?

陳 靜，褚福浩，金珠措姆，索朗次仁，單增卓嘎

1 西藏藏醫藥大學，西藏 拉薩 850000；2 北京中醫藥大學

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤疾病之一。全世界每年死于宮頸癌的女性超過20 萬人。目前，該病的死亡率已攀升至女性癌病的第二位。藏藥普爾那Artemisia vestitaWall.ex Bess.為菊科蒿屬植物全草，具有清熱解毒、殺蟲利濕等功效，藏醫臨床常用來治療蟲病、腦炎、皮膚病、溫毒疔毒瘡、咽喉病等［1-5］，現代研究也用于治療婦科疾病，如乳腺炎、慢性附件炎、痛經等［6］。查閱文獻可知，藏藥普爾那的化學成分有綠原酸［7］、熊果酸［8］、棕矢車菊素、柳穿魚素、中國薊醇、傘型花內酯和薊黃素等，基于熊果酸、棕矢車菊素具有抗腫瘤活性［9-12］，本研究以四唑鹽（MTT）比色法檢測普爾那不同部位的乙酸乙酯提取物、石油醚提取物對宮頸癌海拉細胞（hela cell）的作用，為其科學、合理用藥提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗細胞宮頸癌hela 細胞由中國科學院納米科研中心提供。

1.2 試藥RPMI-1640 培養基（HyClone，批號：AF29584257），DMEM培養基（Gibco，批號：8120350），0.25%胰蛋白酶溶液（Gibco，批號：2177715），磷酸鹽緩沖液（Corning，批號：05717003）；胎牛血清（FBS，四季青，批號：20030502）；噻唑藍（MTT，阿拉丁，批號：20170606）；二甲基亞砜（DMSO，天津百倫斯生物技術有限公司，批號：20170720）；青鏈霉素混合液（Gibco，批號：1640831）。

1.3 實驗儀器3111 型CO2培養箱（Thermo）；生物安全柜（HFsafe）；酶標儀（Multiskan GO）；LD5-2B 型臺式低速離心機（京立）；IX71 倒置熒光顯微鏡（Olympus）；96 孔板（Corning）；離心管（Costor）；其他耗材均為國產耗材。

2 實驗方法

2.1 普爾那提取物制備分別取干燥的普爾納根莖、葉的粉末10 g，加入10倍量80%乙醇，50℃、頻率100%超聲提取3次，每次1 h，濾過，合并提取液，提取液減壓濃縮至無醇味。用水復溶，以乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮至浸膏狀態，烘干，稱質量，得根莖乙酸乙酯提取物（GE）和石油醚提取物（GP）、葉乙酸乙酯提取物（YE）和石油醚提取物（YP）。稱取一定量的GE、GP、YE、YP，分別加入適量的DMSO配制成10 mg/mL的儲備液，其中DMSO占總體積比小于10%。取0.22 μm 的無菌濾膜，過濾除菌，得濾液，備用。

2.2 細胞培養宮頸癌hela細胞培養在含有1%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養液中，置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養，隔天更換培養液。hela 細胞呈貼壁狀態生長，待細胞數量適量、生長狀態良好（對數生長）時傳代培養或鋪板。

2.3 倒置顯微鏡觀察hela 細胞形態根據預實驗結果確定普爾那不同提取物的濃度梯度為125、250、500 μg/mL。將各提取物分別加入到宮頸癌hela 細胞中，培養48 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

2.4 MTT 法檢測hela 細胞的增殖取對數生長期的宮頸癌HeLa 細胞，以3×103個/mL 的細胞數濃度接種于96 孔培養板中，每孔加入100 μL，置于37℃、5%的CO2培養箱中培養24 h，棄去培養基。取一定量的儲備液用新鮮培養液稀釋至系列濃度0、125、250、500 μg/mL 的待測樣品液，在有細胞的孔板中分別加入100 μL 不同濃度的待測液，并設空白組（無細胞，僅加入培養基），測試組與空白組均設置4 個復孔，置于37℃、5%的CO2培養箱中培養72 h。每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT 溶液（避光操作），繼續培養4 h 后終止培養。棄去上清液，加入150 μL/孔的DMSO，充分震蕩，待紫色結晶充分溶解后，用酶標儀測定490 nm下的OD 值，計算不同濃度普爾那乙酸乙酯提取物對肝癌細胞hela 的增殖抑制率，正常組為加入濃度為0 μg/mL的待測液。

2.5 統計學方法采用SPSS 20.0 軟件分析數據，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

125 μg/mL濃度GE、YP、GP對hela細胞增殖有一定的抑制作用，但抑制作用不明顯；高劑量GP和YE 對hela 細胞表現出一定抑制活性；低劑量GE 和YP 對hela 細胞表現出一定抑制活性，隨著濃度的升高，抑制作用降低。見表1。

表1 不同濃度GE、GP、YE、YP對宮頸癌hela細胞增殖的抑制率比較（） %

表1 不同濃度GE、GP、YE、YP對宮頸癌hela細胞增殖的抑制率比較（） %

4 討論

藏藥普爾那具有抗菌、消炎的作用，廣泛用于藏醫臨床［12-14］。體外實驗表明，GP、YE部位隨濃度增加，其對細胞增殖具有一定的抑制作用，而GE、YP 部位則隨著濃度的增加，其對細胞增殖的抑制作用降低［15］。125 μg/mL 的低濃度YP 部位的抑制作用相對最強，抑制率為（65.0±0.30）%。

普爾那提取物對hela 細胞增殖具有一定的抑制作用，其不同部位提取物表現出的抑制規律顯著不同，應進一步研究藏藥普爾那的物質基礎、藥理活性，進行體外、動物毒性實驗，嚴格控制其臨床使用劑量。