基于ERK/MAPK 信號通路探討青藤堿對SW480 結腸癌細胞活性抑制作用的研究?

吳大春，諶雁冰

上海市松江區中心醫院，上海 201600

結腸癌（colon cancer，CC）是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤，好發于直腸與乙狀結腸交界處［1］。流行病學資料顯示，全球每年約有120萬新發結直腸癌患者，發病率男性為16.6/10萬，女性為14.7/10萬，而我國結直腸癌發病率占全世界的18.6%左右［2］，并且隨著生活水平的提高、飲食結構的改變等表現出逐年增加和年輕化的趨勢［3］，受到醫學界的重視。結腸癌一般呈息肉狀、潰瘍型等，可沿腸管蔓延、深層浸潤、腹腔種植等，出現擴散轉移。結腸癌漏診率較高，確診時多屬于中晚期，除外科手術外，化學藥物是治療結腸癌的重要手段。目前。5-氟尿嘧啶占據結腸癌化療的主導地位，也常與其他藥物聯合使用以提高治療效果，但療效并不理想，因此，尋找更為安全有效的藥物對于結腸癌的治療尤為重要。青藤堿是從中藥青風藤中提取的生物堿成分，藥理活性廣泛。陳偉毅等［4］研究認為，其能抑制多種惡性腫瘤細胞的生長，但關于其對于結腸癌影響的研究較少。故本研究，主要探討青藤堿對SW480結腸癌細胞活性抑制作用及對細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞SW480 人結腸癌細胞株，品牌：ATCC，細胞活力：90%（上海素爾生物科技有限公司）。

1.2 試藥與試劑青藤堿（上海寶曼生物科技有限公司，純度：HPLC≥98%，CAS 號：115-53-7，貨號：D0116，規格：20 mg/支），使用時用磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，細胞培養液稀釋成濃度為2、4、8、16、20 mmol/L的青藤堿溶液；RPMI-1640基礎培養液、RPMI-1640 完全培養液（含10%胎牛血清+青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL）（常州貝源鑫生物科技有限公司，批號：20190313、20190221）；PBS、磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）、TBST 緩沖液、0.25%胰蛋白酶溶液（上海聯邁生物工程有限公司，批號：20190405、20190311、20190325、20190209）；細胞增殖及毒性檢測（CCK-8）試劑盒（天津泰澤興業生物科技有限公司，批號：20190116）；藻紅蛋白標記的磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V-PE）法細胞凋亡檢測試劑盒（南京科佰生物科技有限公司，批號：20190530）；RIPA 裂解液（含苯甲基磺酰氟）（北京君諾德生物技術有限公司，批號：20190422）；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（上海經科化學科技有限公司，批號：20190302）；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（長沙達爾鋒生物科技有限公司，批號：20190322）；超敏電化學發光檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：20190508）；鼠抗人B 淋巴細胞瘤2（B lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteine-containing aspartic acid proteolytic enzymes-3，Caspase-3）、細胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）單克隆抗體、鼠抗人肌動蛋白（anti-beta-actin，βactin）多克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（廈門慧嘉生物科技有限公司，批號：20190117、20190209、20190106、20190426、20190218、20190310、20190413）。

1.3 實驗儀器Thermo Forma 3110 型二氧化碳（CO2）細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ROTOFIX32A 型離心機（德國Hettich 公司）；SuPerMax 3000AL 型酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）；Guava EasyCyte 型流式細胞儀（美國MILLPORE 公司）；Powerpac Universal 型電泳儀（美國Bio-rad 公司）；MG6000 型凝膠成像分析儀（北京托摩根生物科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養及傳代［5］取出37℃保存的SW480 細胞，置于含有RPMI-1640 完全培養液的無菌培養瓶內，混勻制成細胞懸液，采用CO2細胞培養箱（37℃、5%CO2）進行細胞培養，待細胞貼壁生長融合＞90%時（對數生長期），倒掉培養液，采用0.25%胰蛋白酶消化液1 mL 處理細胞，3 min 后加入RPMI-1640 完全培養液5 mL 終止消化，吹打制成單細胞懸液，離心半徑：10.5 cm，1500 r/min，離心5 min，細胞沉淀中加入RPMI-1640 完全培養液重懸細胞，之后接種于新的培養瓶進行傳代，繼續培養。

1.4.2 CCK-8 法檢測青藤堿對SW480 細胞增殖的抑制作用［5］取貼壁生長至對數生長期的SW480細胞，倒掉培養液，采用0.25%胰蛋白酶消化液1 mL 處理細胞，3 min 后加入RPMI-1640 完全培養液5 mL 終止消化，吹打制成單細胞懸液，采用RPMI-1640 完全培養液將細胞懸液濃度調整為2×105個/mL。取96 孔板，每孔接種SW480 細胞懸液100 μL，采用CO2細胞培養箱（37℃、5%CO2）進行細胞培養。待細胞貼壁后，棄掉孔內上清液，分別加入2、4、8、16、20 mmol/L 的青藤堿溶液100 μL，每個濃度設6個平行復孔。設對照組（加入0 mmol/L青藤堿溶液100 μL）和空白組（無細胞，僅RPMI-1640 完全培養液100 μL）；采用CO2細胞培養箱（37℃、5%CO2）繼續培養細胞，分別于培養24、48、72 h 后，按照試劑盒說明，除去含藥培養液，每孔加入CCK-8 工作液10 μL，繼續培養4 h；采用Su-PerMax 3000AL 型酶標儀，在450 nm～600 nm 波長處，檢測各孔吸光度A值。之后計算各組SW480細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率（%）=（對照組吸光度A 值平均值-實驗組吸光度A值平均值）/對照組吸光度A值平均值×100%

1.4.3 流式細胞術檢測各組SW480 細胞凋亡情況［6］取貼壁生長至對數生長期的SW480細胞，倒掉培養液，采用0.25%胰蛋白酶消化液1 mL 處理細胞，3 min 后加入RPMI-1640 完全培養液5 mL 終止消化，吹打制成單細胞懸液，采用RPMI-1640 完全培養液將細胞懸液濃度調整為1.5×106個/mL；取6 孔板，每孔接種SW480 細胞懸液200 μL，采用CO2細胞培養箱（37℃、5%CO2）進行細胞培養；24 h后，分別加入0（對照組）、4、8、16 mmol/L的青藤堿溶液100 μL，每組設6 個復孔，繼續培養24 h 后，滴加0.25%胰蛋白酶消化液1 mL 消化細胞3 min，以離心半徑10.5 cm，1500 r/min，離心5 min，棄上清，細胞沉淀用預冷的PBS 洗滌2 次后重懸；取細胞懸液100 μL，按照試劑盒說明書進行操作，加入Annexin V-PE 細胞凋亡檢測試劑100 μL，于避光處培養20 min；上機，采用Guava EasyCyte 型流式細胞儀檢測各組SW480細胞凋亡率。

1.4.4 蛋白質免疫印跡（Western Blot）法檢測各組SW480 細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達水平［7］按照“1.2.3”項中的方法培養SW480 細胞，并分組采用相應藥物處理，采用CO2細胞培養箱（37℃、5%CO2）培養24 h 后取出，以離心半徑10.5 cm，1500 r/min，離心5 min，棄上清，細胞沉淀用PBS 洗滌3 次；加入RIPA 裂解液（含苯甲基磺酰氟）300 μL，4℃裂解30 min 后，以離心半徑8.5 cm，13 000 r/min，離心10 min，上清液中即含有抽提的細胞總蛋白；按照BCA 試劑盒說明書操作進行蛋白定量；加入上樣緩沖液（5×）75 μL，沸水浴5 min 使蛋白變性；配制SDSPAGE 凝膠灌注于電泳儀上，上樣，采用電泳儀分離目的蛋白至溴酚蘭跑出分離膠；將目的蛋白轉膜至硝酸纖維素膜上，用麗春紅S 溶液復染，PBST洗滌硝酸纖維素膜至脫色；TBST 緩沖液（含5%脫脂奶粉）室溫封閉硝酸纖維素膜1 h，之后TBST 緩沖液洗滌；將硝酸纖維素膜分別放入1：1000 稀釋的Bcl-2、Bax、Caspase-3、ERK1/2、p-ERK1/2 及內參β-actin 一抗，4℃孵育過夜；取出硝酸纖維素膜，采用TBST 緩沖液洗膜10 min×3 次，之后置于1∶12 000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG溶液內，室溫孵育1 h，之后TBST 洗滌10 min×3 次；在暗室內，用超敏電化學發光檢測試劑盒處理硝酸纖維素膜，X 光片曝光、顯影、定影，自來水沖洗、晾干。MG6000 型凝膠成像分析儀對目的蛋白條帶進行拍照，Quantity one 軟件分析各蛋白條帶灰度值，計算各組細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白灰度值與β-actin 灰度值的比值，獲得各目的蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析，計量資料采用表示，多組間資料比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SW480 細胞增殖抑制率藥物處理24、48、72 h 后，與對照組比較，青藤堿4、8、16、20 mmol/L組SW480細胞增殖抑制率升高，差異有統計學意義（P＜0.05），且同一時間青藤堿4 mmol/L組＜8 mmol/L組＜16 mmol/L 組及20 mmol/L 組；一定范圍內，青藤堿濃度相同時，處理時間越長，SW480 細胞增殖抑制率越高，表現為劑量、時間依賴性。而青藤堿2 mmol/L 組SW480 細胞增殖抑制率與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；青藤堿20 mmol/L組SW480細胞增殖抑制率與青藤堿16 mmol/L組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。根據檢測結果，選用4、8、16 mmol/L 濃度青藤堿進行后續實驗。見表1。

表1 各組SW480細胞增殖抑制率比較（） %

表1 各組SW480細胞增殖抑制率比較（） %

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；▲表示與青藤堿2 mmol/L組比較，P＜0.05；#表示與青藤堿4 mmol/L組比較，P＜0.05；△表示與青藤堿8 mmol/L組比較，P＜0.05

2.2 SW480 細胞凋亡率流式細胞術檢測結果顯示，與對照組比較，青藤堿4、8、16 mmol/L 組SW480 細胞凋亡率較高，且青藤堿4 mmol/L 組＜8 mmol/L 組＜16 mmol/L 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組SW480細胞凋亡率比較（） %

表2 各組SW480細胞凋亡率比較（） %

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與青藤堿4 mmol/L組比較，P＜0.05；△表示與青藤堿8 mmol/L組比較，P＜0.05

2.3 SW480 細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達水平與對照組比較，青藤堿4、8、16 mmol/L組BcL-2 蛋白表達水平較低，且4 mmol/L 組＞8 mmol/L組＞16 mmol/L 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，青藤堿4、8、16 mmol/L 組Bax、Caspase-3 蛋白表達水平較高，且4 mmol/L 組＜8 mmol/L 組＜16 mmol/L 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3，圖1。

圖1 Western Blot法檢測SW480細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平

表3 各組SW480細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平比較（）

表3 各組SW480細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平比較（）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與青藤堿4 mmol/L組比較，P＜0.05；△表示與青藤堿8 mmol/L組比較，P＜0.05

2.4 SW480 細胞ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達水平與對照組比較，青藤堿4、8、16 mmol/L 組p-ERK1/2 蛋白表達水平較低，且青藤堿4 mmol/L組＞8 mmol/L 組＞16 mmol/L 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組與青藤堿4、8、16 mmol/L 組ERK1/2 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4，圖2。

圖2 Western Blot法檢測SW480細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水平

表4 各組SW480細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水平比較（）

表4 各組SW480細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水平比較（）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與青藤堿4 mmol/L組比較，P＜0.05；△表示與青藤堿8 mmol/L 組比較，P＜0.05

3 討論

結腸癌起源于腸黏膜，其發生主要受到高脂肪及低纖維素飲食的影響，還與家族腫瘤遺傳史、吸煙、飲酒、體力活動不足、紅肉攝入過多、肥胖等危險因素有關［8］。結腸癌發病率居于胃腸道腫瘤的第三位，其起病隱匿，確診時部分病例已失去手術根治時機，只能以全身化療為主要治療手段，但大多數化療藥物的毒副反應明顯，療效也十分有限。近年來許多學者集中探索了在體外環境下中藥提取物對結腸癌細胞系的生長抑制、細胞周期調控作用［9］，為新型植物化療藥物的研發提供了思路，也指出了目前研究的方向。青藤堿是提取自中藥青風藤的活性成分，化學結構與嗎啡類似。秦峰等［10］藥理研究顯示，青藤堿能夠調節免疫功能、抑制炎癥反應，具有抗腫瘤、減輕臟器缺血再灌注損傷、鎮痛鎮靜、降血壓等作用，在類風濕性關節炎、心律失常、腎小球腎炎等疾病的治療中均有較好的應用。關于其抗腫瘤作用，姜宇懋等［11］研究認為，青藤堿能夠通過阻滯細胞G1期，抑制細胞增殖，加速細胞凋亡，降低侵襲轉移能力，抑制腫瘤血管生成，調節腫瘤微炎癥環境，逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性等控制腫瘤進展，對于胃癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤生長抑制作用明顯。楊海波等［12］的體外研究發現，青藤堿能通過阻滯細胞周期進程來抑制人結腸癌SW480 細胞增殖，但具體的作用機制尚未完全明確。

此次研究主要探討青藤堿對SW480 結腸癌細胞活性的抑制作用及對于ERK/MAPK 信號通路的影響。分別采用青藤堿2、4、8、16、20 mmol/L不同濃度的青藤堿處理SW480 細胞24、48、72 h，之后用CCK-8法檢測細胞增殖情況，CCK-8法是目前最具潛力和優勢的細胞活性毒性檢測方法［13］，較MTT 法有操作簡便、檢測周期短等優勢。結果發現，青藤堿4、8、16、20 mmol/L 青藤堿能夠不同程度的抑制SW480 細胞增殖，而且有劑量-時間依賴表現（P＜0.05），表明青藤堿能夠有效降低SW480結腸癌細胞增殖活性，而且藥物濃度越高、作用時間越長，效果越明顯。

細胞凋亡異常可以導致細胞無限增殖，是惡性腫瘤發生發展的病理基礎，同時也是抗腫瘤治療中中藥的作用靶點，可促進腫瘤細胞凋亡，在控制惡性腫瘤進展方面有十分重要的意義。本次研究中，我們采用流式細胞術檢測了不同濃度青藤堿對SW480 細胞凋亡情況的影響，結果發現，與對照組比較，青藤堿4、8、16 mmol/L 組SW480 細胞凋亡率較高，且青藤堿濃度越高，SW480 細胞凋亡率也越高，提示青藤堿能有效加速SW480 細胞凋亡，降低腫瘤細胞活性。

MAPK 信號轉導通路可以將細胞外信號傳導入細胞內，主要包括ERK1/2、c-jun 氨基末端激酶通路、p38 絲裂原活化蛋白激酶通路、ERK5 通路四條信號傳導途徑，其中以ERK1/2 最為保守。ERK1/2 被激活成為p-ERK1/2 后，一方面能夠促進胞質中細胞骨架纖維化，另一方面進入細胞核磷酸化轉錄因子以調節細胞生長、分化等，另外還能在胞質轉紅停留并激活其他蛋白激酶，從而參與細胞增殖、分化、凋亡等過程。殷亮等［14］研究認為，ERK/MAPK 信號通路在結腸癌細胞內呈過度激活狀態，抑制其活性有助于誘導細胞凋亡。Bcl-2、Bax、Caspase-3 凋亡相關蛋白，其中BcL-2 具有抑制細胞凋亡的作用，Bax 為凋亡抑制因子，Caspase-3 則是細胞凋亡過程中重要的終末剪切酶，屬于凋亡效應因子［15］。Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達均受到ERK/MAPK信號通路的調控，p-ERK1/2 進入細胞核內可上調Bcl-2 表達、下調Bax、Caspase-3 表達，從而促進細胞增殖，抑制細胞凋亡［16］。本研究結果顯示，與對照組比較，青藤堿4、8、16 mmol/L 組SW480 細胞Bcl-2、p-ERK1/2 蛋白表達水平降低，Bax、Caspase-3 蛋白表達水平升高，而ERK1/2 蛋白表達水平無明顯變化，而且青藤堿16 mmol/L組變化最明顯，表明青藤堿可能通過抑制ERK1/2磷酸化，降低ERK/MAPK信號通路活性，抑制下游Bcl-2蛋白表達，促進Bax、Caspase-3 蛋白表達，來發揮促進SW480 細胞凋亡的作用，作用效果與藥物濃度有關。

綜上所述，青藤堿能劑量依賴性抑制SW480結腸癌細胞增殖活性，促進細胞凋亡，其作用可能與抑制ERK/MAPK 信號通路活性，調節Bcl-2、Bax、Caspase-3等相關凋亡蛋白表達有關。