獨(dú)活寄生湯對(duì)肝腎不足寒濕痹阻型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Th17/Treg 平衡的影響?

趙海燕，張鴻婷，郭丹丹，張秀榮

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床常見(jiàn)的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、血管翳形成、軟骨及骨組織的破壞為主要特征［1］。近年隨著CD4+T 細(xì)胞中輔助性T 細(xì)胞（T helper cells，Th）的發(fā)現(xiàn)及對(duì)其在RA 中作用研究的不斷深入，輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）的促炎作用和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的抑炎作用以及Th17/Treg的平衡與RA 的密切關(guān)系越來(lái)越受到研究者的重視，以Th17/Treg 作為靶點(diǎn)治療RA 進(jìn)一步推動(dòng)了對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究步伐，成為現(xiàn)階段研究的一項(xiàng)熱點(diǎn)［2］。現(xiàn)已證實(shí)RA 患者外周血中Treg 細(xì)胞數(shù)量減少、功能下降，Th17/Treg 比值升高，且與疾病活動(dòng)度相關(guān)［3］，因此調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡是治療RA 的有效方法。獨(dú)活寄生湯源自《備急千金要方》，目前廣泛用于治療關(guān)節(jié)疼痛，本研究以Th17/Treg 平衡為靶點(diǎn)，觀察獨(dú)活寄生湯對(duì)中、重度RA的臨床療效并探索其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2018年11月至2019年6月在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕科門診就診的RA患者50例，按照隨機(jī)數(shù)字分組法分為觀察組和對(duì)照組，每組25 例，研究過(guò)程中每組失訪1例。觀察組中男6例，女18例；平均年齡（53.17±10.11）歲；平均病程（29.76±11.49）個(gè)月。對(duì)照組中男5 例，女19 例；平均年齡（52.87±10.07）歲；平均病程（30.07±11.10）個(gè)月。兩組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)納入：1）符合2010 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（American college rheumatology，ACR）和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（European league against rheumatism，EULAR）的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］且參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》［5］辨證為肝腎不足寒濕痹阻型者；2）年齡18～65 歲者；3）符合活動(dòng)期RA 診斷標(biāo)準(zhǔn)，且病情評(píng)價(jià)（DAS28 評(píng)分）［6］＞3.2 者；4）本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合知情同意原則且簽署知情同意書(shū)者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)排除：1）合并其他風(fēng)濕病者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、嚴(yán)重膝骨關(guān)節(jié)炎；2）合并嚴(yán)重心腦血管疾病，造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌等嚴(yán)重原發(fā)性疾病，精神病者；3）肝腎功能異常者；4）對(duì)試驗(yàn)藥物（包括基礎(chǔ)用藥、合并用藥）過(guò)敏，或過(guò)敏體質(zhì)（對(duì)2 種及以上藥物過(guò)敏）者；5）妊娠和準(zhǔn)備妊娠的婦女、哺乳期婦女；6）合并各種急慢性傳染性疾病者；7）4 周內(nèi)使用過(guò)糖皮質(zhì)激素或接受生物制劑治療者。

1.4 治療方法1）對(duì)照組根據(jù)病情規(guī)范應(yīng)用西醫(yī)抗風(fēng)濕藥物，包括非甾體抗炎藥和免疫抑制劑。2）觀察組在西醫(yī)規(guī)范治療基礎(chǔ)上服用獨(dú)活寄生湯，藥物組成：獨(dú)活15 g，桑寄生25 g，秦艽15 g，防風(fēng)15 g，細(xì)辛5 g，生地黃15 g，當(dāng)歸15 g，川芎15 g，白芍20 g，懷牛膝20 g，肉桂10 g，茯苓15 g，杜仲25 g，黨參10 g，甘草10 g。水煎服，每日1劑，水煎300 mL，分早晚兩次溫服，每次150 mL。兩組療程均為24周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 療效指標(biāo) 記錄治療前后關(guān)節(jié)壓痛數(shù)（trajectory chart，TJC）、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)（swollen joint counts，SJC）、晨僵時(shí)間、中醫(yī)證候積分、雙手平均握力、視覺(jué)模擬評(píng)分（visual analogue score，VAS）。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 治療前后采集患者外周血：1）采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平（試劑盒購(gòu)自中國(guó)的萬(wàn)類生物公司），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀450 nm讀取吸光值，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。2）采用流式細(xì)胞儀測(cè)定Th17、Treg 細(xì)胞比例：讀取CD4+、IL-17 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的百分比及CD4+、CD25+、Foxp3+、Treg 細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中的百分比，并計(jì)算Th17/Treg 比值（試劑盒購(gòu)自美國(guó)的Thermo 公司及中國(guó)的索萊寶公司）。3）采用免疫印跡法測(cè)定叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3（forkhead transcription facter 3，p-Foxp3）及其磷酸化翼狀頭轉(zhuǎn)錄因子P3（forkhead transcription facter 3，p-Foxp3）表達(dá)水平［材料購(gòu)自wanleibio 公司（產(chǎn)地中國(guó)）及Abgent 公司（產(chǎn)地中國(guó)）］，散射比濁法測(cè)定血C 反應(yīng)蛋白（Creactive protein，CRP），魏氏法測(cè)定ESR水平。

1.5.3 安全性指標(biāo) 檢測(cè)患者治療前后血、尿常規(guī)，肝腎功能，心電圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 療效指標(biāo)TJC、SJC、晨僵時(shí)間、中醫(yī)證候積分、VAS 評(píng)分，兩組治療后均明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；觀察組上述指標(biāo)較對(duì)照組改善明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組治療前后療效比較（）

表1 兩組治療前后療效比較（）

注：與同組治療前比較，*表示P＜0.01；與對(duì)照組治療后比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.2 ESR、CRP、IL-17、IL-10 及TGF-β 水平治療后，兩組ESR、IL-17 水平均明顯降低，IL-10、TGFβ水平均明顯升高，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；觀察組ESR、IL-17 及CRP 降低較對(duì)照組明顯（P＜0.01），IL-10、TGF-β較對(duì)照組升高顯著（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組治療前后ESR、CRP、IL-10、IL-17、TGF-β水平比較（）

表2 兩組治療前后ESR、CRP、IL-10、IL-17、TGF-β水平比較（）

注：與同組治療前比較，*表示P＜0.01；△表示與對(duì)照組治療后比較，P＜0.05

2.3 Th17、Treg 細(xì)胞表達(dá)水平治療后，兩組Th17 細(xì)胞百分比及Th17/Treg 比值均顯著降低，而Treg 細(xì)胞百分比顯著升高，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組上述指標(biāo)較對(duì)照組改善顯著（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組治療前后Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)水平比較（）

表3 兩組治療前后Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)水平比較（）

注：與同組治療前比較，*表示P＜0.01；與對(duì)照組治療后比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.4 Th17、Treg 細(xì)胞表達(dá)的典型病例觀察組1例患者治療前Th17 在CD4+T 細(xì)胞中的含量是18.34%，對(duì)照組1例患者治療前Th17在CD4+T細(xì)胞中的含量是17.30%，與正常對(duì)照者（9.08%）比較均明顯升高，觀察組治療后Th17 在CD4+T 細(xì)胞中的含量是13.44%，對(duì)照組療后是14.09%，觀察組較對(duì)照組治療后Th17細(xì)胞降低的更明顯，見(jiàn)圖1。觀察組1 例患者治療前Treg 在CD4+T 細(xì)胞中的含量是4.26%，對(duì)照組1 例患者治療前Treg 在CD4+T細(xì)胞中的含量是4.81%，與正常對(duì)照者（12.39%）比較均明顯降低，觀察組治療后Treg 在CD4+T 細(xì)胞中的含量是8.37%，對(duì)照組療后是6.56%，觀察組較對(duì)照組Treg 細(xì)胞治療后升高的更明顯。見(jiàn)圖2。

圖1 Th17（CD4+、IL-17+，%）在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 Treg（CD4+、CD25+、Foxp3+，%）在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.5 Treg 細(xì)胞Foxp3 及其p-Foxp3 表達(dá)的典型病例免疫印跡法顯示，兩組治療前Treg 細(xì)胞Foxp3、p-Foxp3 的蛋白表達(dá)量與正常對(duì)照組比較均降低；兩組治療后Treg 細(xì)胞Foxp3、p-Foxp3 的蛋白表達(dá)量均較治療前所增高，且觀察組增高更明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 患者外周血Treg細(xì)胞Foxp3、P-Foxp3的蛋白表達(dá)

2.6 安全性評(píng)價(jià)兩組患者治療前后血、尿常規(guī)，肝腎功能及心電圖無(wú)明顯異常改變，治療過(guò)程中無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生。

3 討論

RA 屬于中醫(yī)“痹證”范疇，多因正氣不足，外邪乘虛而入，致使肌肉、筋骨的氣血運(yùn)行受阻而致痹。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA 為自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制與淋巴細(xì)胞免疫失調(diào)及其產(chǎn)生的大量相關(guān)炎性細(xì)胞因子在患者滑膜組織中浸潤(rùn)有關(guān)［7］，已證實(shí)RA 在疾病的進(jìn)程中Th17 與Treg 細(xì)胞呈現(xiàn)失衡狀態(tài)［8］。Th17 細(xì)胞是一種能夠在核轉(zhuǎn)錄因子RORγt 調(diào)控下特異分泌IL-17 的CD4+T 細(xì) 胞［9］。Th17 細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生IL-17 來(lái)激活巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等，并分泌基質(zhì)金屬蛋白酶破壞骨和軟骨組織［10-11］。有研究顯示［12］，RA 患者血清及關(guān)節(jié)液中IL-17 的表達(dá)明顯升高，促進(jìn)滑膜細(xì)胞分泌多種炎性細(xì)胞因子，抑制軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)和膠原，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，引起骨侵蝕。而Treg 是一種具有免疫抑制活性的CD4+T 細(xì)胞亞群，Treg 細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞因子IL-10 和TGF-β發(fā)揮抑制T 細(xì)胞及抗原呈遞細(xì)胞的功能，降低炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生及抗體分泌而發(fā)揮免疫效應(yīng)。Foxp3 是Treg 重要轉(zhuǎn)錄因子，其持續(xù)表達(dá)是維持Treg 抑制活性的關(guān)鍵因素。初始CD4+T 細(xì)胞在TGF-β的單獨(dú)誘導(dǎo)下，可以分化為Treg 細(xì)胞，當(dāng)IL-6 同時(shí)存在時(shí)，能夠誘導(dǎo)RORγt 的表達(dá)，抑制Treg 細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)初始CD4+T 細(xì)胞分化成Thl7細(xì)胞［13］。本研究顯示RA 患者外周血中Th17 細(xì)胞的含量及IL-17 的表達(dá)水平明顯升高與疾病活動(dòng)度正相關(guān)，與既往研究［14］一致；而RA 炎癥關(guān)節(jié)的細(xì)胞因子環(huán)境抑制了Treg的活性，Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β相應(yīng)減少，致使抑制自身免疫反應(yīng)作用降低，導(dǎo)致炎癥及骨破壞加重［15］。本研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯聯(lián)合西藥治療后患者循環(huán)血中Th17細(xì)胞數(shù)量顯著降低，而Treg細(xì)胞數(shù)量及其相關(guān)因子IL-10、TGF-β的表達(dá)明顯增加，優(yōu)于單純西藥組，且Treg 的轉(zhuǎn)錄因子p-Foxp3 表達(dá)較療前增強(qiáng)，說(shuō)明獨(dú)活寄生湯聯(lián)合西藥治療能夠抑制Th17細(xì)胞分化，增強(qiáng)Treg的活性，調(diào)節(jié)體內(nèi)Th17/Treg 平衡，調(diào)控炎癥因子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)異常免疫反應(yīng)。

綜上所述，獨(dú)活寄生湯聯(lián)合西藥治療可以改善肝腎不足寒濕痹阻型RA 患者臨床癥狀及控制關(guān)節(jié)炎癥，其作用機(jī)制是通過(guò)下調(diào)Th17 細(xì)胞含量，上調(diào)Treg 細(xì)胞含量，調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞平衡，抑制炎性因子的釋放，促進(jìn)體內(nèi)免疫細(xì)胞的平衡，從而控制RA的病情惡化。